《蛋白质分离技术》教学课件

《蛋白质分离技术》幻灯片本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！《蛋白质分离技术》幻灯片本课件PPT仅供大家学习使用Chapter7

蛋白质的分离、纯化和表征Chapter7一、蛋白质的酸碱性质两性电解质可解离基团：-NH3+-COO-侧链上的功能基团见（书P290）氨基酸有的化学性质蛋白质就有。PI=正负电荷相等，净电荷为零时的pH.（见书P291表7-2）一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质分子大小与形状从6000—1000000Dalton(道尔顿）为纪念原子学说（1803年）创始人JohnDalton.Dalton=12C原子绝对质量1/12=1.6603310-27（一）最低分子量测定（二）滲透压（Osmoticpressure）测分子量在理想的溶液中Osmoticpressure与溶质浓度的关系为；=——

C=溶质浓度R=气体常数（0.082)

T=绝对温度=渗透压CRTM二、蛋白质分子大小与形状CRTMM=——RTLim——

cco截距C

/c分子量1万——10万范围内，结果可靠（三）蛋白质的扩散扩散系数（diffusioncoeffecient)(四）蛋白质的沉降分析——超速离心（Ultracentrifuge)测定蛋白质分子量1.沉降速度法（Sedimentationvelocity）沉降系数（Sedimentationcoeffecient)10-13=Svedberg用S表示，生物分子在110-13—20010-13秒范围。Hoemglobin沉降系数4.46S=4.4610-13秒RTcco截距C/c分子量1万——10万范围内，结M=RTSD（1-）（1-）为浮力因子，其中为偏微比容=0.74cm3/g；=容剂密度（g/cm3)D=扩散系数R=气体常数（8.314J/(k.mol))T=绝对温度（K）S=沉降系数2.沉降平衡法

M=————————2RTln(C2/C1)(1-)

2(x22-x21)RTSD（1-）（1-）为浮力因子，其中为(五）凝胶过滤法（gelfiltration)分子筛效应：大分子先洗脱下来

小分子后洗脱下来(五）凝胶过滤法（gelfiltration)分子筛效应：《蛋白质分离技术》教学课件(五）凝胶过滤法（gelfiltration)分子筛效应：大分子先洗脱下来小分子后洗脱下来(五）凝胶过滤法分子筛效应：(六）SDS蛋白质测分子量（sodiumdodecylsulfatepolyacylamidegelelectrophoresis)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳①SDS-蛋白质形成复合物，1.4克SDS与1克蛋白质结合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度负电荷，分子量大小与迁移率成正比。②SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄烟形的长椭圆棒型。(六）SDS蛋白质测分子量（sodiumdod《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件肌球蛋白半乳糖苷酶糖原磷酸化酶牛血清白蛋白卵清蛋白碳酸酐酶大豆胰蛋白酶抑制剂溶菌酶肌球蛋白半乳糖苷酶糖原磷酸化酶《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件三、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀（一）蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是一种分散系统（dispersesystem),蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质（dispersemedium)。属胶体系统（colloidalsystem)蛋白质1.质点大小在1-100nm范围内作Brownmovement.2.质点带有相同电荷，相互排斥3.质点与溶剂形成水化层（hydrationmantle),有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。分散相质点在胶体系统中保持稳定的条件三、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀（一）蛋白质的胶体性质1.（二）蛋白质的沉淀破坏了上述胶体溶液的稳定条件就会沉淀。方法：1.盐析法(saltout)(NH2)4SO4,Na2SO4,NaCl2.有机溶剂甲醇，乙醇，丙酮3。重金属盐pH>pI时P带负电荷与Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+形成不溶性盐4.生物碱pH<pI时，P+—生物碱沉淀5.加热变性沉淀法少量盐加速蛋白质加热凝固。（二）蛋白质的沉淀四、蛋白质分离提纯的一般原则（separationandpurification)1.Pretrestment（匀浆，研磨，超声波）2.Roughfractionation（盐析，等电点，有机溶剂）3.Finefractionation（层析）四、蛋白质分离提纯的一般原则（separationand五、蛋白质混合物的分离方法（一）根据分子大小不同1.超过滤（ultrafiltration)2.密度梯度离心（densitygradientcentrifugal)介质：蔗糖，Ficolls,

3.凝胶过滤层析（gelfiltrationchromatography)

shephadexG-50,G-100五、蛋白质混合物的分离方法（一）根据分子大小不同（二）利用溶解度差别分离蛋白质1。等电点沉淀2。蛋白质的盐溶和盐析3。有机溶剂分级法（三）根据电荷不同的分离方法1。电泳（electrophoresis)①滤纸；薄膜

②粉末平板（硅胶、纤维素粉）③细丝（尼龙丝、人造丝）④凝胶电泳（PAGE、Agarose)圆盘电泳（disc)平板电泳双向电泳等电点聚焦（isoelectricfocusing)（二）利用溶解度差别分离蛋白质1。等电点沉淀圆盘电泳（dis《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件2.离子交换层析2.离子交换层析2.离子交换层析介质：CMCCM-SephadexG-50DEAE-纤维素DEAE-SephadexA-25A-50QAE-SephadexA-50原理见动画片2.离子交换层析原理见动画片(四）蛋白质的选择吸附分离（adsorptionchromatography)介质：活性碳硅胶氧化铝磷酸钙硅藻土（五）亲和层析法

抗原—抗体酶—辅酶酶—抑制剂(四）蛋白质的选择吸附分离《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件六、蛋白质含量测定与纯度鉴定Folin-酚法（Lowry法）凯氏定氮法（标准方法）紫外吸收法（280nm)Bradford法（考马斯亮蓝结合法）可测g蛋白质纯度鉴定：PAGE，SDS，HPLCA280/A260=1.75六、蛋白质含量测定与纯度鉴定Folin-酚法（Lowry法）《蛋白质分离技术》幻灯片本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！《蛋白质分离技术》幻灯片本课件PPT仅供大家学习使用Chapter7

蛋白质的分离、纯化和表征Chapter7一、蛋白质的酸碱性质两性电解质可解离基团：-NH3+-COO-侧链上的功能基团见（书P290）氨基酸有的化学性质蛋白质就有。PI=正负电荷相等，净电荷为零时的pH.（见书P291表7-2）一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质分子大小与形状从6000—1000000Dalton(道尔顿）为纪念原子学说（1803年）创始人JohnDalton.Dalton=12C原子绝对质量1/12=1.6603310-27（一）最低分子量测定（二）滲透压（Osmoticpressure）测分子量在理想的溶液中Osmoticpressure与溶质浓度的关系为；=——

C=溶质浓度R=气体常数（0.082)

T=绝对温度=渗透压CRTM二、蛋白质分子大小与形状CRTMM=——RTLim——

cco截距C

/c分子量1万——10万范围内，结果可靠（三）蛋白质的扩散扩散系数（diffusioncoeffecient)(四）蛋白质的沉降分析——超速离心（Ultracentrifuge)测定蛋白质分子量1.沉降速度法（Sedimentationvelocity）沉降系数（Sedimentationcoeffecient)10-13=Svedberg用S表示，生物分子在110-13—20010-13秒范围。Hoemglobin沉降系数4.46S=4.4610-13秒RTcco截距C/c分子量1万——10万范围内，结M=RTSD（1-）（1-）为浮力因子，其中为偏微比容=0.74cm3/g；=容剂密度（g/cm3)D=扩散系数R=气体常数（8.314J/(k.mol))T=绝对温度（K）S=沉降系数2.沉降平衡法

M=————————2RTln(C2/C1)(1-)

2(x22-x21)RTSD（1-）（1-）为浮力因子，其中为(五）凝胶过滤法（gelfiltration)分子筛效应：大分子先洗脱下来

小分子后洗脱下来(五）凝胶过滤法（gelfiltration)分子筛效应：《蛋白质分离技术》教学课件(五）凝胶过滤法（gelfiltration)分子筛效应：大分子先洗脱下来小分子后洗脱下来(五）凝胶过滤法分子筛效应：(六）SDS蛋白质测分子量（sodiumdodecylsulfatepolyacylamidegelelectrophoresis)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳①SDS-蛋白质形成复合物，1.4克SDS与1克蛋白质结合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度负电荷，分子量大小与迁移率成正比。②SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄烟形的长椭圆棒型。(六）SDS蛋白质测分子量（sodiumdod《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件肌球蛋白半乳糖苷酶糖原磷酸化酶牛血清白蛋白卵清蛋白碳酸酐酶大豆胰蛋白酶抑制剂溶菌酶肌球蛋白半乳糖苷酶糖原磷酸化酶《蛋白质分离技术》教学课件《蛋白质分离技术》教学课件三、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀（一）蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是一种分散系统（dispersesystem),蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质（dispersemedium)。属胶体系统（colloidalsystem)蛋白质1.质点大小在1-100nm范围内作Brownmovement.2.质点带有相同电荷，相互排斥3.质点与溶剂形成水化层（hydrationmantle),有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。分散相质点在胶体系统中保持稳定的条件三、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀（一）蛋白质的胶体性质1.（二）蛋白质的沉淀破坏了上述胶体溶液的稳定条件就会沉淀。方法：1.盐析法(saltout)(NH2)4SO4,Na2SO4,NaCl2.有机溶剂甲醇，乙醇，丙酮3。重金属盐pH>pI时P带负电荷与Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+形成不溶性盐4.生物碱pH<pI时，P+—生物碱沉淀5.加热变性沉淀法少量盐加速蛋白质加热凝固。（二）蛋白质的沉淀四、蛋白质分离提纯的一般原则（separationandpurification)1.Pretrestment（匀浆，研磨，超声波）2.Roughfractionation（盐析，等电点，有机溶剂）3.Finefractionation（层析）四、蛋白质分离提纯的一般原则（separationand五、蛋白质混合物的分离方法（一）根据分子大小不同1.超过滤（ultrafiltration)2.密度梯度离心（densitygradientcentrifugal)介质：蔗糖，Ficolls,

3.凝胶过滤层析（gelfiltrationchromatography)

shephadexG-50,G-100五、蛋白质混合物的分离方法（一）根据分子大小不同（二）利用溶解度差别分离蛋白质1。等电点沉淀2。蛋白质的盐溶和盐析3。有机溶剂分级法（三）根据电荷