第六、七章植物细胞及原生质体培养

植物细胞及原生质体培养第一节植物细胞培养植物细胞培养（plantcellculture）：指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细无性系或再生植物的技术。植物细胞培养的意义：（1）研究细胞生理代谢过程及各种影响因子；（2）用于植物品种的改良（细胞株遗传转化）；（3）用于植物次生代谢物质的生产。单细胞培养细胞的悬浮培养一、单细胞培养（通常以叶片为材料）（一）单细胞的分离 分离方法：机械法（薄壁细胞组织排列松散，细胞间接触少）和酶解法（利用专一性水解酶降解细胞间中胶层）。各有优缺点。（二）单细胞培养 对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。

培养方法：平板培养（浅层液体培养和固体平板培养）、看护培养、微室培养、条件培养基培养法。（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶等)消化分散纯化的细胞，经计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左右的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密封，于25℃培养，约20天后细胞即可生长成团。统计生长情况。（2）看护培养法：从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上用针或玻璃毛细管分离单细胞，每个细胞放在一个方形滤纸片的上表面，而滤纸片放在活跃生长的愈伤组织上进行培养的方法。（3）微室培养法：悬浮单细胞接种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的固体培养基中的培养方法。（4）条件培养基培养：条件培养基是在培养基中加入高密度的细胞进行培养。一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。这样的培养被利用来进行某些单细胞的培养的方法。条件培养基的准备：将液体培养中培养了4~6周的高密度细胞滤掉，将该培养基制成液体培养基或固体培养基用来培养单细胞或低密度细胞群体，可明显提高单细胞培养物存活和分裂能力。二、细胞的悬浮培养(cellsuspensionculture)

是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。适宜于大规模培养，细胞工程产业的技术基础。（一）细胞培养过程：

1.择适宜的外植体；

2.诱导疏松愈伤组织；

3.选择适宜的培养基；

4.悬浮培养；

5.悬浮细胞的继代与选择；

6.悬浮细胞的同步化；

7.悬浮愈伤组织形成及植株再生。

（二）悬浮培养类型：

1.分批培养(Batchculture)：

分批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培养，当培养物增加到一定量时，需继代培养，即取出少量培养物转接于新鲜培养液中。 生长过程与微生物类似，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶段。接种时细胞要达到一定细胞浓度，通常为0.25xl06细胞／ml-0.5x106细胞／m1。

B.半连续培养：是利用培养罐等装置进行细胞大量培养的一种方式。在半连续培养时，当培养容器内细胞增殖到一定数量后，倒出一半细胞悬浮液于另一培养罐等容器，再分别加入新鲜培养基继续培养。半连续培养能够重复获得大量均一的培养细胞供进一步利用。C.连续培养(Continuousculture):

是用一定容积的非密闭系统进行细胞培养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排除系统。分为封闭型和开放型（恒浊、恒化培养）连续培养两种。恒浊培养恒化培养

（三）优良悬浮培养体系要求：

A.悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成。

B.均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。

C.生长迅速，悬浮细胞的量一般2—3天甚至更短时间便可增加一倍。三、细胞培养的特性：

1.植物细胞较微生物细胞大，具有纤维素细胞壁，抗剪切力差；

2.细胞生长速度慢，易受微生物污染，有时需用抗生素；

3.细胞生长的中期及对数期，易凝聚为直径达350um一400um的团块，悬浮培养较困难；

4.培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风搅拌；并具有群体效应

5.培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低，培养过程具有结构与功能全能性。1

四、植物细胞培养的营养需求及培养基１.营养需求：

植物细胞生长所需营养较微生物细胞复杂，除水分外，其它营养成分可分为如下几类：

(1)无机营养:如N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等；

(2)维生素：如维生素B1、B6、烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙及叶酸等；

(3)碳源:如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等；

(4)天然物:

如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸荠汁、生梨汁及苹果汁等；

(5)植物激素:如生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸；其它有油菜素内酯、三十烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；(6)氨基酸类:如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氯酸、苏氨酸、酪氨酿、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；(7)核酸及其水解物:如DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤及胸腺嘧啶等；(8)其它成分:如氯化胆碱、胆质素、胶氨酸、苹果酸及反丁烯二酸等.2.培养基：

(1)固体培养基：添加琼脂等

(2)液体培养基：不加琼脂等第二节植物细胞培养的应用一、植物次生代谢产物的生产

天然植物成分生产、生物转化二、突变体的选择

直接选择、间接选择三、诱导多倍体四、生产人工种子SyntheticseedsofMulberryandbanana（云杉海藻酸钙凝胶）人工种子的保存是难点！第七章植物原生质体培养及细胞融合植物原生质培养和细胞融合可用产生远缘杂种；是目前植物细胞及基因工程的核心技术。一、植物原生质体培养通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露的植物细胞，即为原生质体(Protoplast)。游离的原生质体像正常的植物细胞那样具有全能性，在一定条件下培养可以重新再生出完整植株。

自1970年首次获得烟草原生质体再生植株成功以来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余种，其中有20种为我国首先报道。原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。(一)原生质体的制备：1、材料来源与预处理：（1）材料来源：可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。

（2）预处理：

A.预质壁分离：17-20℃酶液中静置半小时，再于28-34℃保温，或将材料置于与酶液中糖浓度相同的溶液中预培养1h左右，再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的；

B.预培养:

将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养7天，再用酶消化去壁，所得原生质体分裂频率较高；

C.暗处理:将室温下生长5-7个星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其叶片制备的原生质体有活力；

D.光处理:将叶片于日光或灯光下照射2—6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生质体分离；

E.低温处理:夏季应用的实验材料其萌动种子应于4℃过夜后再播种，从其植株叶片上分离的原生质体培养效果较佳。2.制备原生质体的酶类：高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素，其次为半纤维素、果胶质及蛋白质。细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构不同，木质化及次生加厚的细胞壁不被酶消化，故选择材料和消化细胞壁的酶类是制备原生质体关键。常用的酶类有：A.纤维素酶，如OnozukaR—10及RS，国内常用的为EA3-867，其中含少量果胶酶；B.半纤维素酶，如RhozymeHP150，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离;C.果胶酶，如MacerozymeR—10又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过2％，作用时间长有毒害作用；此外亦用PectalyaseY—23，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为0．1％，悬浮细胞为0．05％；D.崩溃酶（Driselase)，为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性；E蜗牛酶，主要用于体细胞原生质体分离。

酶液配制：

需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl2·2H20(0.1mmol/L一10mo1/L)及KH2PO4(0.75mmol/l)等渗透稳定剂，以维持原生质体完整性。酶液pH值相当重要，纤维素酶及果胶酶单独使用时，其pH分别以5.4及5.8为宜；混合使用时pH5.4-pH5.6为宜，降至4.8以下则原生质体破裂。

酶液配制后需以0.45um微孔膜过滤除菌，而不可采用加热灭菌法。

3．原生质体分离及纯化（1）分离：原生质体分离有机械法（质壁分离）及酶消化法，前者产量极低而不多用、后者又分一步法及二步法。

一步法是将材料在2l一28℃用纤维素酶及果胶酶混合液一次性处理2—24h。

二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素酶脱壁而释放原生质体。（2）纯化

A.沉降法:原生质体混合物经微孔过滤后，低速（150g）离心5min,沉淀再用与酶液具相同糖浓度溶液反复洗3-4次，后用培养液洗涤备用（方便但纯度不高）；

B.飘浮法:离心法纯化的原生质体若含较多碎片及少量老细胞时．可用20％蔗糖离心，原生质体浮于液面．碎片及老细胞沉降而得以纯化，纯度高，但产量低；

C.不连续梯度离心法：将原生质粗提液置于不连续浓度梯度的溶液中，经离心后分离不同比重的原生质体，优点是原生质体均匀一致、纯度高，缺点是得率低。

4．原生质体活力测定

纯化的原生质体需经活力测定后方可用于培养。（1）根据形态待征判断其活力：原生质体呈绿色（若来源于叶片）及圆而鼓者为活原生质体。（2）荧光染料活体染色法：荧光素染料（荧光素二乙酸酯法，FDA）可自由透过活细胞膜，在细胞内被酯酶水解为荧光素，在荧光显微镜下根据荧光强度即可判断原生质体死活。（3）酚藏花红染色法：活原生质体能吸收呈红色，无活性的则不能吸收而无色。（二）原生质体培养：

1.培养方法：（1）固体培养：平板培养法，易观察和获得单细胞系，但植板率低。（2）液体培养：

A.浅层培养法:其过程是将1m1原生质体（调整好密度）悬液置于直径4cm培养皿或25m1三角瓶中使成薄层后于培养箱中培养．初期振摇1—2次，防止粘壁；

B.固液结合培养法：在混好原生质体的固体培养基表面加一层相同成分的液体培养基进行培养。效果较好。C：双层培养法：原生质体在液相中。2.培养条件：

密度：平板培养103~104个/ml,

液体培养104~105个/ml温度：多数为25-28oC,少数16~37oC光照：多数要求黑暗或弱光影响原生质体培养的因素：

原生质体活性：健康的外植体、分裂旺盛的愈伤组织；原生质体起始密度：5×103~5×105渗透压稳定剂：0.3%~0.5%mol/L的甘露醇；0.4%mol/L的葡萄糖；培养基：葡萄糖/氮源/激素及浓度；培养条件：暗培养，植物材料和基因型：甘蓝型、芥菜型和白菜型油菜难度不同；木本植物难度高于草本植物。电击和热击：刺激作用，促进DNA合成，分化再生基因表达。3.细胞壁再生及细胞分裂：

l一3天即再生新细胞壁，表现为体积增加、膨大，再由圆变椭圆。可用质壁分离法证实。也可用0.1%ST型或WBL型荧光增白剂染色，经前者染色，有细胞壁者在荧光显微镜下呈蓝色荧光。经后者染色，有细胞壁者发射绿色荧光。在原生质培养过程中，胞质增加，液泡减少，叶绿体或颗粒内含物分散于泡质中或围绕于细胞核周围．常在1一2周内发生第一次分裂。不同细胞分裂频率不同。4、愈伤组织或胚状体形成

原生质体再生的细胞一旦开始分裂，就可能继续生长：

A形成细胞团，发育成愈伤组织；

B.形成胚状体，再产生植株；

C.形成愈伤组织，再形成胚状体。随着细胞分裂及细胞团形成，已与常规细胞和组织培养相同，故培养3—4周需添加含一定量低渗稳定剂的新培养基，以满足细胞的营养，亦利于细胞团及小愈伤组织的生长。

5.植株再生

大多经愈伤组织诱导分化再生为完整植株。当愈伤组织达到1—2mm时，转移至分化培养基上诱导器官分化。分化培养基与原生质体培养基差别在于：

(1)只用蔗糖为碳源，不加渗透稳定剂；

(2)与原生质体培养基相反，细胞分裂素浓度高于生长素;(3)在诱导器官分化过程中，一般采用1500lx左右的高光强。诱导器官分化的温度与原生质体培养基本相同。

（三）原生质体培养的目的：

1、利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移植和外源物的摄取，原生质体之间可以进行融合而产生杂种细胞(即体细胞杂交）。2、是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。3、也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异和植物病理学研究的有用工具。A-D当归(Angelicasinensis(Oliv)Diels)原生质体培养成再生苗

E-H,红豆草(OnobrychisvicaefoliaScop))原生质体培养再生植株A-E,培养的欧当归(LevisticumofficinaleKoch)原生质体分裂再生成植株的过程

F-L,培养过程的核变化；F.多核，G.核穿壁，H.无丝分裂，I.染色体桥，J.2n=22，K.L.多倍体.二、原生质体融合：

在外界因素作用下，两个或两个以上植物