Southern杂交技术手册

Southern探针标记及检测试剂盒：DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII〔detectionwithCSPD〕原理(hexanucleotidedATP、dCTP、dGTP、dTTPDIG-dUTPDNAKlenowDNACSPDX试剂盒内容：DIG-HighPrime，vial1，50ul〔5×〕；DNA，vial2，20ul〔5ug/mlpBR328DNA〕；DNAvial3，〔3×1ml〕；APConjugate，vial4，50ul〔750U/ml〕；2-8℃稳定保存。CSPD，vial5，50ml；2-8℃避光稳定保存。在-15～-25℃2-8℃1DIGEasyHybGranules，vial7，4×100ml。1过程设备试剂过程设备试剂DIG水浴、电炉双蒸水，灭菌；0.2MEDTA溶液pH8.，灭菌。探针灵敏度检测尼龙膜〔Hybond-N+NylonMembrane〕洗脱缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液转膜烘箱TBE，酸变性液，碱变性液，中和液，20×SSC杂交杂交炉、杂交瓶20×SSC，1%SDS免疫检测洗脱缓冲液；马来酸缓冲液；检测缓冲液；重杂交水浴20×SSC；1%SDS；1MNaOH试剂配制：pH〔11.61g高压灭菌洗脱缓冲液：取灭菌后的马来酸缓冲液，参与0.3%〔v/v〕的Tween-20，常温。50ml，2.925gNaCl500ml，高压灭菌〕。gEDTA-Na2800mlNaOH，当EDTANaOHpH8.0pH8.0〕1000ml,于室温下短期存放。211mlHCl1000ml，室温可1〕1000ml，3〕MNaCl〔87.66gNaCl，60.5gTris-base，1000ml，HClpH7.5，3〕9．20×SSC——3MNaCl，0.3M柠檬酸钠〔175.5gNaCl，88.2g柠檬酸钠，10MNaOHpH7-8，1000ml，高压灭菌〕SDS——5gSDS，500ml3显影液：温水〔50℃〕米吐尔〔对甲氨基酚硫酸盐〕无水亚硫酸钠几奴尼〔对苯二酚〕无水碳酸钠：溴化钾加冷水至定影液热水〔60-70℃〕结晶硫代硫酸钠无水亚硫酸钠醋酸硼砂〔四硼酸钠〕钾矾加冷水至

800ml3.5g60g9.0g40.0g3.5g1000ml600ml240g15g48ml7.5g15g1000ml3一、DIGA、1ugDNA16ul；B10min，DNA；3-5min；匀，2023rpm，30s；、37℃1hE2ul0.2MEDTA6510min，终止反响；F、标记探针在-20℃12标记探针的产量DNA1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2023ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng二、探针灵敏度检测预备试剂盒中各组分的工作溶液3各组分的制备溶液溶液制备储存条件用途封闭液〔vial6〕10现用现配封闭膜上非特异性1×结合位点抗体溶液〔vial4〕每次使用前，将vial2-812h结合DIG标记的探4在10000rpm离心针5min；从外表吸取所需用量，用封闭液按1:10000〔750mU/ml〕稀释4制备梯度稀释标记探针和比照DNADNA2DNA1ulvial2，4ulddHO2试管号DNA〔ul〕来源管号DNA〔ul〕试管号DNA〔ul〕来源管号DNA〔ul〕稀释倍数终浓度1起始Vial31ng/ul2211981:10010pg/ul3152351:3.33pg/ul452451:101pg/ul553451:100.3pg/ul654451:100.1pg/ul755451:100.03pg/ul856451:100.01pg/ul90-50-0操作步骤A2-9DNA1ulB1200×100uj/cm230s120℃30min；，15-252min；D10ml30min；E10ml30min；重复两次；G10ml2-5min；0.1mlCSPD没有气泡，15-255min；I、将尼龙膜移到保鲜膜上，封好后于暗室夹上X15-20min〔15-25℃〕J、洗X光片，暗室中放三只比X光片大的塑料盘子，依次装上显影液，自来水和定影液。其冲洗程序同洗相片一样。注：整个过程中必需使尼龙膜保持潮湿。5三、印迹〔高盐转膜法〕和固定酶切l，DNA全都，假设亮度差异太大，则应进展进一步的浓度校正。10μg/100μl,的酶切体系，两个重复。酶切完成后用真空浓缩仪浓缩到上样需要的量〔60μl〕的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分D3/40.8%1XTBE260-300mlMarker〔7.5μl〕点在样品旁边250V1040V电12~1410cmG、电泳完毕后，将胶放在干净的玻璃板上切出多余的的凝胶，凝胶点样孔一端EBUVP凝胶处理A180使溴酚蓝变成黄色。HClDNA10kbDNAC20-30min。D、把胶浸入碱变性液中，室温浸泡30min，间或轻轻振荡至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色。E2。3．印迹A20×SSC4X20X30cm滤纸。20×SSC之间的气泡后再按同样的方法铺上其次层滤纸，6X光片条把胶的四周DNA分印迹到尼龙膜上。E能再移动〕。20×SSC10cm500gG4-68-1018-24小时胶上的DNA一般都能充分转移至尼龙膜上。6×SSC5min，用滤纸将剩余液体吸干；I、DNA10×SCC在成像仪上进展紫外交联，交联完毕后，用双蒸水洗膜，空气枯燥；注：假设不想连续检测，可将膜用保鲜膜包好后放在2-8℃保存。四、杂交1DIGEasyHyb〔预杂交液〕，37℃5min。2．确定杂交温度GC〔L〕确定杂交温度。T=49.82+0.41〔%G+C〕-〔600/L〕mT=T-20℃25℃opt m3．操作步骤A、按10ml/100cm2膜预热确定体积的预杂交液〔DIGEasyHyb〕至杂交温度37-42℃，将尼龙膜置于装有预杂交液的杂交管中，杂交炉中预杂交30min；BDNA〔25ng/ml〕5min，马上置于冰上冷却；C、将变性的标记DNA探针参与预热的杂交液〔DIGEasyHyb)中〔4ml/100cm2膜，7杂交液，混匀，不应产生泡沫〔防止产生背景；D4h-24h。-15℃至-2568℃孵育10min；预杂交液不能煮沸。五、洗膜和免疫检测1．洗膜5min2B0.5×SCC，0.1%SDS〔65-68℃15min，2注：当探针长度大于150bp且G/C含量较高时，洗膜温度应为68℃。2．免疫检测1-5min；30-50min；C20ml30min；2-315min；E20ml2-5min；1mlCSPD没有气泡，15-255min；G、挤出多余的液体将塑料膜封好，37℃10min；H、将尼龙膜移到保鲜膜上，封好后于暗室夹上X15-25min〔15-25℃〕I、