大脑皮层中的神经代谢耦合反映突触活动多于峰电活动

大脑皮层中的神经代谢耦合反映突触活动多于峰电活动在非侵害性的神经成像中，神经活动由脱氧血红蛋白的局部波动来推断。功能性磁共振成像（fMRI）的根本问题是推断的神经活动主要是由突触活动还是峰电活动来推动。答案对fMRI中血氧水平依赖性（BOLD）信号的解释来说非常关键。本文中我们使用固定的视觉系统电路来产生一个刺激，以引发没有刺波发放关联的突触活动。在猫初级视觉皮层的神经和代谢活动记录中，我们观察到：没有峰电时局部场电位（LFPs）和组织氧浓度改变间存在强耦合。这些结果显示：BOLD信号与突触活动耦合更紧密。BOLDfMRI已经成为基础和应用神经科学的中心工具，因为它提供了大脑中神经激活的非侵害性图像。然而，BOLD信号不能直接度量神经活动，但它能度量脱氧血红蛋白（dHb）聚集处的局部波动1-5。由于技术进步改进了fMRI的空间分辨率，fMRI在定量BOLD信号和其推断的神经活动间的相互关系方面日益重要6，7。特别地，BOLD信号主要反映神经元输入（突触活动）还是神经元输出（放电活动）仍然是不清楚的。使用已知的视觉路径的显著性质，我们能把这两种量度分开来确定它们在组织氧含量改变中的相对作用。通过氧—血红蛋白解离曲线和组织中的局部氧浓度梯度发现组织氧含量和dHb相关。另外，BOLD信号和组织氧含量同样受脑血容量（CBV），脑血流量（CBF）和氧消耗（脑中氧气的代谢率，CMRO2）改变的影响8-10。因此，组织氧含量改变暗示了BOLD信号中类似的改变的假设是合理的。我们以前已经使用了一个二元显微电极（UnisenseA/S）来对脑皮层的细胞外的相同区域进行组织氧含量和神经活动的同步测量11。这种技术允许我们在亚毫米水平上检测神经代谢耦合。Clark型极谱氧传感器测量氧压的改变，在测量范围内氧分压与组织氧含量线性相关12。这些细胞外相同区域神经元活动同步测量以多单位放电活动（MUA）和局部场电位（LFPs）的形式记录，这些测量通常被认为来测量突触活动13-18。这种方法的一个优点就是测量的分辨率高，这样我们能用来观察视觉刺激的细微处理对组织氧反应的影响。结果组织氧含量和LFPs的时间频率调谐我们先前的研究主要集中在视觉刺激的空间性能。现在的研究中，我们使用时间特性来分辨突触和放电活动，如下所述。为了建立这种分辨方法的基础，我们进行了预备试验来验证组织氧反应和LFP反应中都存在时间频率调谐。典型的猫初级视皮层到色质中的组织氧，MUA和LFP以四个时间频率在刺激（图1）。组织氧反应的正峰振幅从20Hz时变化13.33%到4Hz时变化22.97%。MUA反应在500Hz和8Hz之间用带通滤波器过滤，反应强度通过记录平均诱导放电频率并扣除自发频率来确定（平均放电频率间隔时间在30-44s之间）。测定的MUA平均值从20Hz时每秒放电3.65次到4Hz时每秒放电26.05次。LFP反应在0.7Hz到170Hz之间用低通滤波器过滤，频带定义如下：δ（0.7-4Hz），θ（4-8Hz），α（8-12Hz），β（12-25Hz），γL（25-90Hz），γH（90-170Hz）。这些频带的频率根据先前实验选定19，20。功率可调作为测定LFP反应强度的一种方法。可调功率通过测定每个频率的功率来计算，用平均基线功率划分（刺激开始前1s），并计算频带的总和。γL频带总的可调功率从20Hz时67.32dB延伸到4Hz时77.11dB。图1.组织氧，MUA和LFP反应的时间频率调谐。组织氧，MUA和LFP信号（6个点±1s.e.m处的平均值）跨越四个时间频率（1，4，10和20Hz）的用最大响应（实验的平均值）进行标准化。组织氧反应（O2）以百分数形式用平均正峰振幅来表示。MUA反应以刺激存在时平均放电频率减去平均自发频率表示。LFP反应表示所有频带（δ，θ，α，β，γL和γH）总和的可调频率。组织氧反应有两部分（图1）。初始负部分，或者是初始下降峰，被认为与CMRO2的改变有关9，21，但是延迟的正部分，或者说正峰，表明CBF的变化9，13，15。在神经，血管和代谢反应的共同测量中必须要考虑的一个因素就是它们发生在完全不同的空间范围内。我们假定LFPs集中于2-3mm2范围，MUA集中于300-800μm2（文献22，23）。相应地，CBF的增加被认为是一个面积约2mm2的总和（文献21），但是CMRO2的变化似乎位于一个面积约为200μm2的范围（文献11）。本文中，我们通过以百分数形式计算正峰的振幅来确定组织氧反应的数量。这是基于估计CBF和LFP空间范围的测量方法。MUA，组织氧和所有的LFP频带对1-Hz时间频率刺激的反应（图1）是强烈的。通过测量对4-Hz的刺激同样强烈。反应强度的一致性在更高时间频率下开始减弱。在10Hz时，MUA轻微减小并且和组织氧反应的强度的差异增加。本文中，在α到γH频带（8-170Hz）的反应明显比组织氧和MUA反应的高（t检验，P=0.025-0.0497；β反应与组织氧没有明显不同，t检验，P=0.0513）。差异在20Hz时变得更加显著，当MUA反应强烈减弱时，就像低LFP频带的反应一样。然而，组织氧和γL频带反应仍然很强。这和先前研究一致，先前研究主要研究了LFP时间频率调谐24。对这些点，在组织氧和γ频带活动之间的耦合独立于时间频率，和组织氧与MUA之间的关系不同。放电活动和突触活动的不相关已经确定了在组织氧和LFP反应中存在时间频率调谐，我们进行了使放电活动和突触活动分离的实验。我们的方法基于稳定的观察，观察发现早期视觉路径的神经（外侧膝状体，LGN）比位于视觉皮质中的神经被调节到更高时间频率25。皮层4和6接受来自LGN的直接输入。尽管在这些皮层中存在颅内连接，我们假设LGN输入处于主导地位26。这意味着总的胞外电位反映出对于时间频率刺激突触活动比放电活动普遍。对其他视觉因素的另一好处是皮质图谱。尽管方位和空间频率图谱已被识别27，28，但对时间频率还没发现没有相同的结构。这表明不同时间频率的神经激活范围一致。对我们的实验来说，我们用完全反差的双目全漂移（60°）正弦光栅作为刺激物。此光栅的空间频率为0.2圈/度，用峰值MUA调谐确定首选方位。我们使用了三个测试条件：低时间频率（2或4Hz依托于峰值MUA调谐），高时间频率（30Hz，基于刺激存在检测器的刷新率）和空值（无刺激）。在13个位点发现了显著的组织氧反应（t检验，1.00×10-16≤P≤0.0028；26个值中的24个，P＜0.0005）。我们观察神经元放电，发现对4-Hz刺激的强MUA反应和对30-Hz刺激没反应（图2a）。相反地，对4-Hz刺激和30-Hz刺激都有明显的组织氧反应。和预想一样，在空值条件下组织氧反应和MUA反应和基线信号一样，或者噪音。图2.对强（60°）刺激的反应的样品记录点。（a）放电-时间柱状图（暗蓝区域）和氧反应是32次试验平均。氧反应周围实心灰线显示±1s.e.m。（b）LFP光谱图用所有实验平均信号调节功率来计算。图示的为对4-Hz和30-Hz刺激及无刺激时的反应。4s刺激期间用双筒漂移正弦光栅刺激，如a图中垂直灰线和a与b图顶部的阶梯函数。LFP光谱图（图2b）显示可调的信号功率是频率和时间的函数。在对4-Hz刺激的反应频带上信号功率明显增加，尽管反应强度在刺激存在一秒后减弱了。在对30-Hz刺激的反应中，开始信号强度的增加没有4-Hz刺激时强，特别是在γL和γH频带。然而，尽管信号强度随时间变化，但此条件下刺激过程中信号功率仍有明显的增加，特别是在频率低于50Hz时。组织氧和MUA反应一样，控制条件下的LFP光谱图显示的是基线噪音，刺激没有产生影响。对弱刺激的反应为了探索从18区到组织氧反应LGN传入和周期反馈的相对作用，我们用视觉刺激在较高空间频率（0.5-0.7圈/度）检验了另外4个记录点。另外，我们在这些点使用较弱刺激来减少电极测定区域外MUA活动导致组织氧反应的可能性（图3）。与对较强刺激的反应相似，对4-Hz刺激有强烈的MUA反应，但是对30-Hz刺激和控制条件下没有发现MUA增强。与早先研究预期的一样，这些弱刺激引起的组织氧反应与由强刺激引起的组织氧反应不一样20。对于4-Hz刺激，组织氧反应特征主要是开始强烈的下降峰。对于30-Hz刺激，开始也有一个小的但显著的（t检验，P=8.09×10-8）下降峰。4-Hz和30-Hz的组织氧反应都与空值条件下的不同（t检验，P=6.58×10-8和P=2.64×10-12，分别地）。这些发现与预想的弱刺激引起强烈的神经和代谢活动的局部变化一致。我们先前已经说明开始的下降峰在所有产生强烈神经反应的点中是最大的11。本文中，没有MUA的存在表明开始的下降与LFP功率的同时增加是有联系的。对4-Hz和30-Hz刺激开始都有强烈的LFP反应（图3b）。开始刺激后500ms对4-Hz的反应强度减弱，但是整个刺激期间不同频带的功率保持强烈的增加。对30-Hz的反应也是在开始刺激后500ms强度减弱，但是减弱程度比4-Hz条件下严重，并且在刺激期间的其他部分发现25到60Hz间功率增加非常微弱。图3.在高空间频率处对弱刺激的反应。（a）放电-时间柱状图（暗蓝区域）和氧反应（实心蓝线）是48次试验平均。（b）LFP光谱图的计算和图2中的一样。刺激物与图2中的一样，除了刺激物处于视觉区域的10°之上（集中于峰值MUA活动确定的感受区上），空间频率为0.7圈/度。频带的LFP反应我们分析了所有17个记录点的LFP反应，通过计算每个频带刺激持续期间可调LFP功率之和来确定总的LFP功率（图4）。如上面看到的（图2和图3），对30-Hz刺激的LFP反应比对较低时间频率（2或4Hz）刺激的LFP反应弱。然而，对这两种类型刺激的反应在以下方面相似，就是频率在25和60Hz之间有一个强反应（γ带的较低频率部分）。这些发现与早期报道的γ频带活动与BOLD信号之间相关性很强相一致14，18，20，23，29。60Hz以上的γ频带的信号强度的相对减弱验证了较低和较高γ频带之间存在区别的理论。近期关于初级视皮层的研究也表明伽马频带的较低频率部分（30-50Hz）有较强的反应29。考虑到γ频带定义有较大的可变性，这是值得注意的14，18，20，23，29。我们的结果表明γ频带的较低频率部分（25-60Hz）与突触活动的关系比较高LFP频率与突触活动的关系更密切。图4.总体数据：所有点的平均LFP反应。LFP反应（n=17）数量通过计算每个频带的可调功率的和来确定。实心黑线描述的是对低时间频率条件（2或4Hz依托于峰值放电调谐）位点的平均反应减去平均空值反应。实心灰线描述的是对高时间频率条件（30Hz）的平均反应减去平均空值反应。误差棒表示所有位点±1s.e.m。讨论先前对处理是否BOLD信号与放电或突触活动关系很紧密的问题的尝试靠的的是通过相关系数的比较17，18。这些分析已经得到了对神经变化（就是，MUA对BOLD和LFPs对BOLD）相似的关系值。因为MUA和LFPs之间有很高的相关性，所有这些结果很难解释。我们通过使这两种神经活动分离来避免这个问题。尽管我们的结果显示较低频率γ频带（25-60Hz）的活动与组织氧反应的关系最紧密，但我们也发现在其它频带的刺激依赖性反应。这两种类型的刺激（低和高时间频率）在α和β频带也引起强烈的反应。β活动与γ频带的活动关联性很强24，尽管其函数关系还不清楚。在α频带也发现了对高反差视觉刺激的高LFP功率20。因为刺激物放在完全反差处，我们在α频带也发现高LFP功率就不足为奇了。也发现了对30-Hz反应的α带的相对强度。近期研究发现α带活动与自上而下的抑制过程有关30，31。这与来自LGN的高时间频率的信息受初级视皮层的颅内抑制的理论相一致25，32，并能解释高时间频率刺激时α带活动的普遍性。本文中，我们证明了视觉皮层中记录点处放电反应对刺激引起的组织氧变化是不必要的。我们也发现了在γ频带较低频率部分这些表现出这种行为的点处有强的LFP反应。总的来说，这些发现表明组织氧的变化与LFPs的联系比其与神经元放电行为的联系要紧密。通过推断，我们的结果表明BLODfMRI信号主要反映的是突触活动而不是放电活动。方法准备动物。动物处理遵从美国国家卫生研究院颁布的实验动物护理和使用指南进行。成年猫先用1.5-3%的异氟醚气体进行麻醉。中心体温保持在38℃。接着进行前蹄股静脉插管术，中断异氟醚用连续的静脉内注射芬太尼（10μg/kg体重）和硫喷妥钠（6mg/kg﹒h-1）保持麻醉。然后进行气管切开术，动物用含25%氧气和75%氮气的混合气体进行人工呼吸。实验过程中监测脑电图，心电图，中心体温，气管内压力和呼出的CO2。17区的开颅术使用P4L2霍斯里-克拉克(Horsley-Clarke)立体定向仪进行，为了插入电极将硬脑膜去除。用泮库溴铵（0.2mg/kg﹒h-1）诱导麻痹。记录期间，呼吸调节呼吸次数在每分钟14到23次之间来保持呼出的CO2水平在33到39mmHg。记录位点。所有记录都用UnisenseA/S3000APOX探头来做。我们不能通过组织学来确定皮层深度，因为此装置不能产生伤口。因此，所有深度的测量都以微电极推进器的读数为准。电极首先置于17区皮层表面下500μm处，然后在此点测定一个强的神经放电活动（＞每秒放电8次）。数据分析不包括不是由适当视觉驱动产生放电频率的位点。一个位点的所有重复刺激完成后，将电极移至另一200μm处，搜索位点的过程以100μm的增量重复进行。视觉刺激。视觉刺激用全视野正弦波光栅，它以0.2圈/度的空间频率显示于阴极射线管（CRT）监测器（平局亮度50cdm