染色质免疫沉淀专家讲座

基因型决定表型染色质免疫沉淀专家讲座第1页破坏了基因型也就改变了表型染色质免疫沉淀专家讲座第2页不过，也有一些无法解释现象在对应基因碱基序列没有发生改变情况下，一些生物体表型却发生了改变。染色质免疫沉淀专家讲座第3页什么是表观遗传学?是DNA及其染色质环境稳定改变，这些可遗传改变并不包括DNA序列突变。染色质免疫沉淀专家讲座第4页表观遗传修饰

在不影响DNA序列情况下改变基因组修饰，不但能够影响个体发育，而且还能够遗传下去。这类变异被称为“表观遗传修饰”，并被认为是造成遗传物质一致孪生子出现个体差异主要原因。染色质免疫沉淀专家讲座第5页染色质重塑染色质重塑在广义上是指染色质结构动态调整或重新塑造染色质结构。在一些核内因子作用下，染色质DNA与其包绕关键组蛋白之间亲和力改变或相对位置改变使得染色质结构变得较为涣散，DNA更易于暴露。染色质重塑就是经过这么改变来调控基因转录。在狭义上，染色质重塑专指由ATP提供能量、经过依赖于ATP染色质重塑复合物改变组蛋白与DNA结合状态，在靠近关键组蛋白DNA表面建立特殊构象，使转录因子较易于靠近DNA过程。染色质免疫沉淀专家讲座第6页染色质免疫沉淀技术发展使染色质重塑研究得以进步染色质免疫沉淀专家讲座第7页试验目标学习掌握染色质免疫沉淀技术基本原理与关键操作步骤。染色质免疫沉淀专家讲座第8页试验原理染色质免疫沉淀专家讲座第9页试验流程一、交联及染色质DNA剪切条件优化准备一瓶靠近长满HeLa细胞，向培养液中加入37%甲醛至终浓度为1%，轻轻摇匀，在37℃孵育10分钟。

①甲醛作用②细胞用量③交联条件对试验结果影响弃培养液，用预冷至4℃带蛋白酶抑制剂PMSF1×PBS洗细胞两次，刮细胞到一个2ml离心管，rpm，4℃离心4min搜集细胞。

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甲醛作用在各种交联试剂中，甲醛（HCHO）应用最为广泛。甲醛浓度、作用时间及交联温度等均可能影响交联程度。甲醛能够经过赖氨酸、精氨酸和组氨酸以及那些DNA氨基和亚氨基基团之间交联，高效地在体内交联蛋白质-DNA、蛋白质-RNA以及蛋白质-蛋白质，形成生物复合体，预防细胞内组分重新分布。除此之外，HCHO能够忠实地保留染色质结构，而且在温和条件下交联很轻易逆转。通常交联所用甲醛终浓度为1%，在12-37℃作用30min。不过假如反应温度超出30℃，本底就可能增加。所以，当必须在高温进行交联时，则应降低作用时间或甲醛浓度。过分交联将影响细胞裂解，而且在超声处理时不能取得理想长度DNA片段及影响DNA溶解。对于尤其轻易进行交联目标蛋白质（比如，组蛋白）需降低交联时间或甲醛浓度。甲醛交联反应可被加入甘氨酸终止。染色质免疫沉淀专家讲座第11页细胞用量通常2.5×108细胞足够进行4次免疫沉淀。所以，普通为了确保用量，采取培养多瓶细胞，胰酶消化，搜集在50ml离心管中，培养液重悬，计数。（普通分装1х107细胞于一个EP管，用于免疫沉淀反应）。

交联条件对试验结果影响对于不一样细胞类型，甲醛浓度、交联长度或者交联温度都需要调整。假如交联不充分，会造成不完全固定，则DNA片段平均长度会小于500bp。交联过分时细胞染色质难以用超声波破碎，就算延长超声波作用时间也会造成主要原料丢失。交联时间假如过短，则交联不完全，产生假阴性，交联时间通常为5分钟到1个小时，详细时间依据试验而定。染色质免疫沉淀专家讲座第12页3.用500μl预热至室温带有蛋白酶抑制剂SDS裂解液重悬并裂解细胞，冰浴10分钟；超声波处理剪切染色质DNA，使其形成300-1000bp即大约相当于2-5个核小体长度片段；

①超声条件对试验影响及超声注意事项②设置超声破碎条件③酶消化与超声消化相比较区分染色质免疫沉淀专家讲座第13页

①超声条件对试验影响及超声注意事项

超声波是使用机械力断裂染色质，轻易引发升温或产生泡沫，这都会引发蛋白质变性，进而影响ChIP效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续超声程序，确保低温。另外，超声探头要尽可能深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。染色质免疫沉淀专家讲座第14页②设置超声破碎条件超声处理条件通常能够设置为10秒每次，共3-4次，功率为50W时设置为最大功率30%，采取2mm超声头。不一样超声处理仪器设置不太一样，探索超声条件时，能够先固定其它条件，先确定每次超声多长时间不会造成显著发烧，然后探索不一样超声次数。直至找到比较适当超声次数能够使大部分基因组DNA断裂成200-1000bp大小。需要注意是每次超声体积和细胞用量宜固定，不然就不能使用一个相对比较固定超声条件用于后续试验。染色质免疫沉淀专家讲座第15页③酶消化与超声消化相比较区分MicrococcalNuclease能够将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理结果更精巧，更均一。另外，酶反应条件比较温和，对DNA和DNA-蛋白复合物损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适合用于新鲜细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采取没经过甲醛固定NativeChIP（N-ChIP）研究方法。因为N-ChIP没经过甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和DNA结合，所以只能选择酶处理染色质方法。对于甲醛固定样品，普通选择超声波处理方法。也有研究人员使用酶处理方法研究甲醛固定较温和样品。Millipore企业有商品化MicrococcalNuclease处理ChIP试剂盒（EZ-Enzyme）提供。染色质免疫沉淀专家讲座第16页Enzyme和sonication处理结果比较染色质免疫沉淀专家讲座第17页

超声处理条件需要优化，各试验组可采取不一样超声波处理条件，比较剪切效果。按以下步骤操作比较各种条件下剪切效果：a.将超声处理过样品离心搜集上清（4℃13000rpm离心10分钟），加入10μl0.5MEDTA、20μl1MTris-HClpH6.5、2μl20mg/ml蛋白酶K，45℃孵育0.5-1小时；b.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μlddH2O中，1.2%琼脂糖凝胶电泳检验。试验组12345678超声次数3691136911超声功率15W15W15W15W25W25W25W25W此页内容不在正常ChIP步骤中染色质免疫沉淀专家讲座第18页酚/氯仿抽提步骤

按照1：1体积比加酚/氯仿充分混匀后离心，取上层水相至新管，加入1/10体积3MNacl，2倍体积无水乙醇，大转数离心5min染色质免疫沉淀专家讲座第19页5.将超声处理过样品在4℃13000rpm离心10分钟搜集上清，10倍稀释，将其移入一新2mlEP管中；6.按照每2ml稀释后液体加入75μl百分比加入蛋白A-琼脂糖/鲑精DNA(50%混悬液)，4℃摇动30分钟，预处理，短暂离心(700-1000rpm4℃，小于1分钟)，搜集上清液；

①Beads选择②Input设置7.向2ml上清液中加入适量抗乙酰化组蛋白H3抗体(20μl)，4℃摇动过夜，阴性对照组不加抗体一样摇动过夜；

①抗体选择②对照设置二、免疫沉淀染色质DNA片段染色质免疫沉淀专家讲座第20页

①Beads选择利用目标蛋白质特异抗体经过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物，然后使用Agarosebeads或Magnabeads沉淀此复合物，特异性地富集与目标蛋白结合DNA片段。再经过屡次洗涤，除去非特异结合染色质后，用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。Magnabeads是近年来出现一个新型beads，它使用方便，不像Agarosebeads那样轻易破裂，所以在操作过程中更简单，而且免去了离心步骤，节约不少时间。Millipore企业最新推出MagnaChIP试剂盒就是采取这种Magnabeads。染色质免疫沉淀专家讲座第21页免疫共沉淀和染色质免疫沉淀input设置在进行免疫沉淀步骤前样品染色质免疫沉淀专家讲座第22页染色质免疫沉淀抗体选择ChIPValidated染色质免疫沉淀专家讲座第23页②对照设置ChIP试验最少应设置3种对照：①未经免疫沉淀超声处理样本（input）；②阳性对照。普通用组蛋白抗体或anti-RNAPolymeraseII抗体这些比较保守在全部细胞中都能结合基因蛋白抗体；③阴性对照。即用一个无关抗体（或对应动物免疫前血清），与抗目标蛋白质抗体同时分别与交联染色质样本进行免疫沉淀反应；④选择不与目标蛋白质结合基因组区域作对照，即“基因组对照”。另外，还应依据对ChIP不一样特殊应用设置不一样试验对照。比如，试图检测目标蛋白质是否与某一推测结合位点结合，则必须将此位点突变后作为对照；又如，欲测定突变细胞株中目标蛋白质与基因组DNA结合情况时，必须用野生型细胞株作对照等。染色质免疫沉淀专家讲座第24页8.加60μl蛋白A-琼脂糖/鲑精DNA(50%混悬液)，4℃摇1小时；短暂离心(700-1000rpm，4℃，小于1分钟)搜集沉淀，分别用低盐免疫复合物洗液、高盐免疫复合物洗液、LiCl免疫复合物洗液洗涤沉淀各一次，每种液体每次用1ml，摇动3-5分钟后短暂离心搜集沉淀。然后用一样方法用TE缓冲液洗涤沉淀两次三、PCR判定结合于乙酰化组蛋白H3DNA片段10.向上步所得沉淀中加入250μl洗脱液(1%SDS,0.1MNaHCO3)，震荡，室温孵育15分钟，离心搜集上清；染色质免疫沉淀专家讲座第25页11.加入10μl0.5MEDTA、20μl1MTris-HClpH6.5、和2μl20mg/ml蛋白酶K，45℃孵育0.5-1小时；12.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μlddH2O中，取1μl作模板，按以下配方加样，PCR扩增试验组和对照组以及Input组GAPDH开启子序列，扩增条件95℃1分钟，95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒、30个循环，72℃5分钟，1.5%琼脂糖电泳检验结果。①此步DNA纯化能够选择适当DNA纯化试剂盒②PCR策略染色质免疫沉淀专家讲座第26页PCR策略

引物选择取决于试验目标。如若判定目标蛋白质特异结合位点，除了必须设计一对能使扩增片段跨过该位点引物外，最少还应设计一对扩增DNA序列中没有目标蛋白质结合位点对照引物。对于平均长度为500bpDNA分子，它大部分片段长度是500-1000bp，以至远离真正结合位点1000bp处DNA序列很可能被抗体共沉淀下来。所以，对照引物扩增DNA区域与试验引物扩增DNA区域之间距离必须大于1000bp。引物设计依据通用引物设计标准。有时为提升扩增产