表观遗传学与肿瘤专家讲座

表观遗传学与肿瘤表观遗传学与肿瘤专家讲座第1页表观遗传学概念表观遗传学是研究不包括DNA序列改变、可遗传基因表示调控方式学科；普通来说,细胞基因组中除了DNA和RNA序列以外还有很多调控基因表示信息,即使它们本身不会改变基因序列,不过能够经过对DNA修饰、蛋白质与蛋白质、DNA和其它分子间作用,影响和调整基因功效,而且经过细胞分裂和增殖周期影响遗传,这些都属于表观遗传学所研究范围。表观遗传学与肿瘤专家讲座第2页表观遗传概念与机制表观遗传是指基因表示或蛋白表示改变不包括基因DNA序列改变、但可随细胞分裂和增殖而稳定遗传现象。表观遗传机制对于人体各种细胞生长和分化都是主要，如X染色体失活等一些正常细胞生理功效都由表观遗传所决定。伴随年纪增加或环境影响，细胞正常表观遗传状态可能被打破，从而造成促癌基因异常活化或抑癌基因失活、促进肿瘤形成。表观遗传修饰主要包含DNA及一些与DNA亲密相关蛋白质化学修饰，一些非编码RNA也在表观遗传修饰中起主要作用；所以表观遗传修饰可从DNA、组蛋白、染色质及RNA等多个层面上调控基因表示。常见表观遗传修饰机制包含：基因组印记、DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA、染色质重塑表观遗传学与肿瘤专家讲座第3页一、DNA甲基化与肿瘤在早期发育阶段，甲基化和非甲基化交替是细胞得以生长和分化关键程序，有确保细胞正常发育和基因组稳定性主要作用在正常细胞内，开启子区胞嘧啶磷酸鸟嘌呤(CpG)呈非甲基化状态，而大多数散在分布CpG二核苷酸常多发生甲基化。DNA甲基化普通与基因缄默相关，非甲基化则与基因活化相关，去甲基化往往与缄默基因重新激活相关。表观遗传学与肿瘤专家讲座第4页正常甲基化对于维持机体功效是必需，如基因印记、X染色体失活、细胞分化、胚胎发育等；而异常DNA甲基化则会引发疾病甚至肿瘤发生，异常CpG重新甲基化通常被认为是人类癌症发生早期特征人类肿瘤细胞株中，许多肿瘤相关基因5’端开启子区CpG岛发生高甲基化，如一些抑癌基因、细胞周期调整基因、肿瘤转移抑制基因、DNA修复基因及血管生成抑制基因。有些在不一样癌症中高甲基化，有些只在特定癌症中甲基化；恶性肿瘤另一个特点是重复序列如卫星DNA和寄生DNA甲基化程度降低，低甲基化基因组不稳定、易突变；在许多癌症中，细胞整体展现低甲基化水平，并伴随肿瘤进展，低甲基化水平加强；基因整体甲基化水平降低可增加一些基因表示，如ras、myc等原癌基因活化，形成突变热点、转座子异常表示、基因不稳定等，促进肿瘤发生表观遗传学与肿瘤专家讲座第5页Paz等对人类12种肿瘤70多个肿瘤细胞系进行了15个基因系统分析：每种肿瘤最少有1种基因开启子区发生高甲基化；这种开启子甲基化含有肿瘤类型特异性；结直肠癌DNA错配修复基因(hMLH1)、O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-MGMT)、金属蛋白酶组织抑制剂3(TIMP)乳腺癌仅O6-MGMT基因高甲基化信号路径关键位置基因异常甲基化可造成该路径异常激活或抑制Wnt路径中Wnt抑制因子-1(WIF-1)基因，编码蛋白与Wnt配体竞争卷曲蛋白受体结合、阻断Wnt信号，为该路径负反馈调整基因，该基因异常高甲基化与鼻咽癌、膀胱癌、食管癌等各种肿瘤发生相关表观遗传学与肿瘤专家讲座第6页基因CpG位点是自发突变主要位点，人类肿瘤P53基因突变25%发生于该位点，结直肠癌者达50%表观遗传学与肿瘤专家讲座第7页DNA甲基化与早期诊疗：能够检测体液中一些基因异常甲基化状态，为肿瘤早期诊疗。如检测肺癌患者痰液中P16甲基化状态作为肺癌辅助诊疗伎俩检测粪便中分泌型卷曲相关蛋白2基因甲基化状态诊疗结直肠癌DNA甲基化与肿瘤发展及预后结肠腺瘤性息肉病基因(APC)开启子甲基化可预示宫颈癌转移和复发、并提醒患者处于高危状态肝癌细胞钙粘蛋白基因甲基化与血管浸润及肿瘤转移相关基因异常甲基化还可与染色体缺失协同抑制基因表示，而且有互作效应表观遗传学与肿瘤专家讲座第8页卷曲同系物9(FZD9)基因非甲基化、该位点染色体不发生缺失骨髓增生异常综合征转化急性髓系白血病患者1年总生存率约为90%；基因甲基化、且该位点染色体不发生缺失患者1年总生存率约为75%；基因非甲基化且该位点染色体发生缺失患者1年总生存率达40%左右，而基因甲基化、且该位点染色体发生缺失患者1年总生存率仅15%左右。表观遗传学与肿瘤专家讲座第9页组蛋白修饰与肿瘤染色质通常由DNA、组蛋白、非组蛋白及少许RNA组成，组蛋白是染色质基本结构蛋白；组蛋白N-末端可经过甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等翻译后修饰，改变DNA与组蛋白之间相互作用，影响染色质涣散与集缩，从而激活或抑制转录，其中以组蛋白甲基化、乙酰化尤为主要；组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰基酶(HDAC)协调催化完成；修饰部位普通位于N-末端赖氨酸残基，如H3上9号和14号、H4上5、8、12、16号；表观遗传学与肿瘤专家讲座第10页组蛋白乙酰化是一个可逆动力学过程，能够调整基因转录；组蛋白末端赖氨酸残基高乙酰化与染色质涣散及转录激活相关，低乙酰化与基因缄默或抑制相关。组蛋白乙酰基转移酶催化组蛋白尾部赖氨酸残基乙酰化，造成局部DNA与组蛋白八聚体紧密缠绕被解开，使各种转录因子能与DNA调控元件相结合，促使基因发生转录；组蛋白去乙酰化酶异常结合到开启子区，从而抑制正常功效基因转录也可能是恶性肿瘤发生机制之一表观遗传学与肿瘤专家讲座第11页组蛋白甲基化甲基化位点多位于组蛋白H3、H4赖氨酸或精氨酸残基，由组蛋白赖氨酸甲基转移酶催化，而去甲基化由赖氨酸去甲基酶催化；赖氨酸可单、双、三甲基化，精氨酸可单、双甲基化，增加了组蛋白修饰复杂性经过组蛋白甲基化位置，可判断基因是被激活还是抑制H3-K9和H4-K20甲基化与基因缄默相关；H3-K4、K36、K79甲基化可使基因激活组蛋白修饰能够引发核小体结构改变,造成染色质重塑,影响各类转录因子与DNA结合,进而影响基因转录。组蛋白乙酰化对于维持组蛋白功效和DNA转录是必需,组蛋白乙酰化失衡将引发对应染色体结构和基因转录水平改变，影响细胞周期、分化及凋亡,并可造成肿瘤发生表观遗传学与肿瘤专家讲座第12页染色质重塑：指染色质位置、结构改变，包含紧缩染色质丝在与核小体连接处发生松动，造成染色质解压缩，从而暴露基因转录开启子区中顺式作用元件，为反式作用因子与之结合提供可能。两类结构介导：ATP依赖核小体重塑复合体，经过水解作用改变核小体构型；组蛋白共价修饰复合体，催化对关键组蛋白N-末端尾部进行共价修饰，改变核小体构型，为其它蛋白提供与DNA作用结合位点；动态染色质重塑是大多数以DNA为模板生物学过程基础，如基因转录、DNA复制与修复、染色体浓缩与分离、细胞调亡等，因而异常染色质重塑与肿瘤发生与发展直接相关不一样染色质重塑可造成不一样肿瘤，但其与肿瘤发生与发展关系还有待深入探索表观遗传学与肿瘤专家讲座第13页非编码RNA调控非编码RNA分为长链非编码RNA和短链非编码RNA。长链非编码RNA在基因簇甚至整个染色体水平发挥顺式调整作用；短链RNA在基因组水平对基因表示发挥调控作用。短链RNA能介导mRNA降解、诱导染色质结构改变从而决定细胞分化命运、对外源核酸序列有降解作用以保护本身基因组，常见短链RNA有小干涉RNA(ShortinterferingRNA，SiRNA)和微小RNA(MicroRNA,miRNA)。干扰RNA：与真核生物mRNA编码区同源外源性双链RNA(dsRNA)能特异性地诱导其同源mRNA降解，造成对应基因缄默，hx现象称为RNA干扰(RNAi)，RNAi依赖于小干扰RNA与靶序列之间严格碱基配对，有很强特异性；微小RNA：由核内Pri-miRNA在RnaseⅢ核酸酶作用下加工成发夹状pre-miRNA，转运到胞质后在双链RNA特异性RNA内切酶(Dicer)作用下被切割成双链miRNA。解链成单链后进入核糖蛋白复合体，参加对mRNA切割或翻译抑制。表观遗传学与肿瘤专家讲座第14页RNA干扰分为两个阶段：酶切开启阶段：外源双源RNA(dsRNA)经过外源导入、转基因、或者病毒感染等方式进入细胞后，专一性双链RNA内切酶识别dsRNA并将其切成大量碎片(siRNA)，能识别同源靶mRNA序列，开启RNA干扰；RISC形成：siRNA与特异性蛋白结合后解链，其反义链与核酶复合物结合，形成诱导RNA缄默复合物(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)。RISC形成后结合到靶mRNA上，在RNA依赖RNA聚合酶催化下形成dsRNA，后者又会在双链RNA内切酶作用下降解为siRNA。siRNA天然作用是封闭转座子，它们能在染色质水平、转录水平、转录后水平、基因水平对基因表示进行调控。试验室研究表明，部分miRNA与各种肿瘤、癌症发生亲密相关。表观遗传学与肿瘤专家讲座第15页不一样表观遗传修饰之间相互调控：表观遗传修饰能从多个水平上调控基因表示，而不一样水平调控之间又相互关联，在真核细胞内形成了一个完整表观遗传调控网络。miRNA表示受甲基化及其它表观遗传机制调控；siRNA可诱导DNA甲基化表观遗传学与肿瘤专家讲座第16页肿瘤细胞表观遗传学异常分子机制印记丢失：遗传印记是指，来自父母双方等位基因在经过精子和卵子遗传给子代时发生了修饰，使带有亲代印记等位基因含有不一样表示特征。正常基因印记受DNA甲基化和组蛋白甲基化及乙酰化调控，以确保父系基因决定地位，即一对等位基因中一个发生转录，另一个被抑制。肿瘤中一些基因丢失其遗传印记会造成异常情况发生，如等位基因共表示。如：胚胎细胞只有母系染色体时成为畸胎瘤、只有父系染色体时成为葡萄胎；结肠癌患者结肠上皮类胰岛素生长因子2(IGF2)等位基因共表示，致强效生长刺激，与不停升高结肠癌风险相关；而在Wilm’s瘤，IGF2基因印记丢失，产生一个异常未分化细胞，其不停增生而不受调控及修复基因影响，最终引发肾癌；表观遗传学与肿瘤专家讲座第17页基因印记丢失小鼠模型：Holm等经过破坏DNA甲基转移酶DNMT1，暂时诱导基因组脱甲基化，从而建立基因印记丢失小鼠模型。来自该模型成纤维细胞可在免疫缺点小鼠体内形成肿瘤，并含有体外永生特征。Holm认为，单独印记丢失就可使细胞发生癌性增生。因为细胞降低了永生化域值，在没有基因突变情况下，可遗传基因表示模式改变造成干细胞异常增生，进而诱发肿瘤发生、发展。表观遗传学与肿瘤专家讲座第18页DNA甲基化肿瘤表观遗传学异常以DNA甲基化模式改变为主，包含整个基因组低甲基化和开启子区高甲基化；当前最受关注是开启子区CpG岛高甲基化造成抑癌基因转录缄默，这很可能是癌性增生最初表现；Issa等研究证实存在CpG岛甲基化表型，即同时存在多个基因含有肿瘤特异性CpG岛甲基化。常见抑癌基因P16就是因为开启子区CpG岛高甲基化而缄默，该基因功效丢失可延长干细胞寿命、造成基因组不稳定性、早期癌性病变易于发生。与肿瘤异常甲基化状态相关酶是DNA甲基转移酶(DNMTs)，其催化在CpG岛胞嘧啶5位上共价连接上甲基基团。表观遗传学与肿瘤专家讲座第19页DNMT酶包含DNMT1、DNMT3b和DNMT3a，DNMT1与甲基化维持相关，即在半甲基化DNA中以甲基化单链为模板对互补链进行甲基化；DNMT3b和DNMT3a介导DNA双链从头甲基化。各种组织起源肿瘤细胞可DNMT蛋白及活动水平增高，DNMT抑制剂抑制DNMT活性可延缓小鼠肺癌模型中癌性增生。试验研究发觉基因敲除DNMT1后，肿瘤总体甲基化水平仅微弱降低，而敲除DNMT3b可使95%基因组5-甲基胞嘧啶去甲基化、全部开启子去甲基化、缄默基因活化表示。说明DNMT1功效以维持甲基化及基因表示抑制为主，而DNMT3含有从头甲基化作用。尽管DNMT1对于未甲基化物质几乎无甲基化作用，但其过分表示依然可造成未甲基化人类CpG岛序列从头甲基化，所以，其在肿瘤细胞很可能含有上述能力。表观遗传学与肿瘤专家讲座第20页组蛋白修饰与染色质重塑：核小体是染色质高级结构基本结构，组蛋白是核小体主要组成部分，核小体由147对碱基包裹8个组蛋白组成关键蛋白组成，147对碱基位置和组蛋白修饰对于维持基因表示模式及染色体结构含有主要作用，以此来调控基因表观遗传。核小体各组分处于精细稳定状态，任何外界微小改变可能对细胞表型及转录模式产生巨大影响对于染色质包装来说，组蛋白修饰与DNA甲基化之间有亲密联络，各种选择型去乙酰化酶、DNMTs复合体、特定甲基化CpG序列结合蛋白家族(MBDs)之间相互联络。在调控基因转录时甲基化和赖氨酸乙酰化之间相互协作，但甲基化起主导作用；MBDs含有特异性结合基因开启子能力，和DNA高甲基化及肿瘤中缄默基因相关表观遗传学与肿瘤专家讲座第21页组蛋白乙酞基转移酶(HATs)和组蛋白去乙酞化酶(HDACs)相互作用调整组蛋白乙酞化平衡，同时组蛋白甲基转移酶(HMTs)和组蛋白去甲基化酶有效调控着组蛋白甲基化；组蛋白赖氨酸乙酞化与转录激活相关联，而这些残基甲基化则同时与激活以及抑制状态相关；组蛋白乙酞化和甲基化模式经过不一样效应蛋白而表示，含有bromo结构域蛋白质，能够识别乙酞化赖氨酸残基；含chromo结构域，能够结合到甲基化赖氨酸残基上，作用于组蛋白并引发基因转录。赖氨酸甲基化有单甲基化，双甲基化以及三甲基化3种不一样形式，他们显著扩大了组蛋白复合体密码信息。比如，H3K9乙酰化和H3K4甲基化是表示活跃标志;而H3K9和H3K27单、双和三甲基化大量出现则是转录抑制相关组蛋白甲基化标志。表观遗传学与肿瘤专家讲座第22页早期肿瘤表观遗传学改变调控潜在网络表观遗传学改变在干细胞异常克隆性增殖及肿瘤易感性方面发挥关键作用对慢性炎症造成肿瘤研究发觉，正常细胞对细胞应激和损伤应答是暂时，抑制细胞存活，而慢性暴露于应激状态下则引发上述应答反应异常延长从而可能造成异常克隆增生。上述异常应答反应包括SIRT1异常增加、抑癌基因p53转录抑制、HIC1缄默：SIRT1是一个多功效应激蛋白，组蛋白去乙酰化酶Ⅲ一个，参加p53基因翻译后修饰、从而下调p53转录活性；HIC1基因是锌指结构域组员，既是p53激活目标，又与SIRT1组成复合体并向SIRT1开启子聚集、抑制其转录；表观遗传学与肿瘤专家讲座第23页SIRT1去乙酰化作用还可造成并维持配对基因转录缄默，诱导降低SIRT1活性能够使这些缄默基因重新表示，这一过程包括到Wnt发育信号通路；Wnt发育信号通路对成人细胞更新时干细胞扩增及维持有主要作用；在结肠癌时，因为反抗Wnt信号路径SFRPs基因家族首先发生了缄默，随即当下游通路基因突变时，因为拮抗原因，使Wnt通途经度激活，从而促进肿瘤发展；而肿瘤细胞试验时，敲除SIRT1基因能够使已经缄默SFRPs基因重新激活，从而逆转结肠癌及乳腺癌中Wnt路径过分激活；SIRT1和PcG复合物在肿瘤中异常基因缄默维持过程中可能共同发挥主要作用。表观遗传学与肿瘤专家讲座第24页HIC1基因纯合性缺失或表观遗传丢失均可造成SIR1基因表示增加，从而降低p53对正常细胞作用；HIC1基因表观遗传缄默也包括其它路径，HIC1基因缄默后可造成Wnt通路过分激活。HIC1结合TCF-4后能够募集p-catenin到紧凑核结构上，组成HlC1体，就会妨碍驱动正常Wnt通路正常核p-catenin-TCF复合体形成。表观遗传学与肿瘤专家讲座第25页肿瘤表观遗传学在干细胞及酵母中研究过去观点认为，成熟干细胞发生异常克隆性增生，造成细胞异质性不停增强，所以很多肿瘤展现出一系列演进过程；新观点强调肿瘤增生是由肿瘤干细胞引发，肿瘤干细胞内一些分子能够促进肿瘤发展，如特定干细胞Oct4过表示可促进肠及其它器官上皮细胞肿瘤快速发生。胚胎干细胞中，细胞干细胞化转录因子包含：OCT4、NANOG、SOX2，都定位于一个限制性开启子区域，这些转录因子、细胞增殖调控基因、组织分化调控基因都普遍与干细胞多潜能性相关，大多保持低甲基化状态。表观遗传学与肿瘤专家讲座第26页细胞干细胞化相关转录基因近侧开启子区包含PcG蛋白及三甲基化H3K23，在胚胎发育中，当基因需要表示时，PcG影响可被逆转或消失，到后续细胞成熟或分化阶段，PcG复合物作用可重新