【课件】基因工程的基本操作程序课件2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序-13.2

基因工程的基本操作程序

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）

科学家将苏云金杆菌的“杀虫基因”——Bt抗虫蛋白基因转到棉花里，让棉花也能产生产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。

抗虫棉的培育过程2.基因表达载体的构建(核心)1.目的基因的筛选与获取3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定Bt基因Ti质粒重组DNA分子将目的基因插入染色体DNA中目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。一.第一步：目的基因的筛选与获取目的基因主要是指编码蛋白质的基因抗逆性基因生产药物基因毒物降解基因工业用酶基因1.筛选合适的目的基因：（1）方法：①从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白也有较为深入的了解。因此，筛选Bt基因作为培育转基因抗虫棉的目的基因。②随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为科学家找到合适的目的基因提供更多机会和可能。一.第一步：目的基因的筛选与获取（和扩增）

2.目的基因的获取和扩增方法2、从基因文库中直接获取1、人工合成3、利用PCR获取和扩增目的基因一.第一步：目的基因的筛选与获取（和扩增）701人工合成在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。DNA合成仪转基因抗虫棉在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成

2.目的基因的获取和扩增方法根据已知的氨基酸序列合成DNA蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成一.目的基因的筛选与获取2.目的基因的获取方法(2)人工合成人工合成DNA序列可以说是一种从无到有的的合成。例如ATCG四核苷酸序列，先将G的5’端利用特定药剂进行保护，3’端暴露，然后加入3’端保护的C，并进行合成反应，这样就可以合成3’CG5’,然后去掉C的3’保护基团，再加入3’端保护的T，继续缩合形成3’TCG5’,这样依次进行，最后合成3’ATCG5’，这与PCR的原理是不同的。01从基因文库中获取基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。

2.目的基因的获取和扩增方法基因组文库:部分基因文库:包含一种生物的全部基因（cDNA文库）基因文库类型：包含一种生物的部分基因构建的方式不一样；且真核生物cDNA文库中的基因片段会改变基因文库的构建

科学工作者分离得到了某原核生物基因，并将其解离成两条单链。现让其中一条链与由该基因转录而来的信使RNA杂交配对，结果如图所示。非编码区非编码区编码区信使RNA基因的一条链ＡＢＣ（1）原核生物基因成熟信使RNA对应基因的一条链非编码区非编码区（2）真核生物基因编码区非编码区非编码区启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点开始转录编码区

原核生物基因终止子：终止转录非编码区：位于编码区上游与编码区下游功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达

启动子：RNA聚合酶结合位点转录起始的信号

终止子：终止RNA的合成编码区：编码蛋白质中的氨基酸序列拓展：非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345加工mRNA前体成熟mRNA基因上不能编码蛋白质的序列有：内含子+非编码区序列基因上不能编码蛋白质的序列有：外显子12345启动子终止子真核生物基因转录成熟信使RNA对应基因的一条链非编码区非编码区（2）真核生物基因【思考1】从基因组文库中获得的胰岛素基因，若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是

。胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素【思考2】从部分文库中获得的胰岛素基因，若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是

，而需要在体外加工形成胰岛素或将目的基因导入酵母菌中获得。大肠杆菌无内质网、高尔基体等细胞器，对胰岛素原不具有加工、修饰、分泌功能。基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以PCR由穆里斯等人（先入为主）于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖

如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。

历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献。钱嘉韵第一个分离出Taq聚合酶。利用PCR获取和扩增目的基因

2.目的基因的获取和扩增方法PCR技术：全称聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）可以在短时间内大量扩增目的基因原理操作环境优点：PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）的缩写。在体外条件下扩增DNA的方法。

2.目的基因的获取和扩增方法DNA的半保留复制过程PCR和DNA的体内复制过程是否完全相同？不完全相同；PCR是双链全部解开后再延伸子链DNA在体内的半保留复制：PCR:

条件：模板、原料、能量、酶

模板：DNA的两条链（母链）

原料：四种游离的脱氧核苷酸

能量：一般由ATP

酶：解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶

特点：半保留复制、边解旋边复制细胞内DNA复制与PCR对比一样一样（dNTP）一样耐高温的DNA聚合酶半保留复制引物什么是引物？为什么需要引物？

引物1.引物是一小段与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸（20-30个核苷酸）。

2.DNA双链解旋之后DNA聚合酶无法直接聚合游离的脱氧核苷酸

(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。3.由于DNA双链是反向平行的，所以需要2种引物。3’5’DNA母链3’5’DNA母链3’5’引物3’5’引物引物设计注意：1、引物自身不能环化2、两种引物之间不能互补配对3、引物长度不宜过短，防止引物随机结合4、引物在目的基因两侧【例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。

第1组：

；

第2组：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效现学现用：若想获得以下已知序列的DNA片段，设计了一些PCR引物，应选用的PCR引物是______(从引物①②③④中选)DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′AACTATGCGCTCATGA3′②5′GCAATGCGTAGCCTCT3′③5′AGAGGCTACGCATTGC3′④5′TCATGAGCGCATAGTT3′③①现学现用：若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，若想获得未知序列，选用的PCR引物应是______②④耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）PCR条件:四种脱氧核苷酸(dNTP)激活DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。PCR反应过程第二轮循环的产物第三轮的产物3’5’3’5’3’5’3’5’第一轮循环的产物3’5’3’5’【特别提示】PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。DNA扩增成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。①n代后，DNA分子有_____个②n代后，DNA链有_____条③n代后，含引物的DNA分子有_____个④n代后，共消耗_____个引物2n2n+12n2n+1-2(1)在PCR技术扩增目的基因时

（需要/不需要）解旋酶，原因是

。(2)利用PCR技术扩增目的基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计

种引物，进行PCR时需加热至90∽95度然后冷却至55∽60度，此操作的目的是

。【例1】不需要PCR过程中是通过高温使DNA双链解聚为单链的，而不是用解旋酶两①90∽95度高温使DNA解聚为单链，②然后冷却至55∽60度使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合（3）利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入两种引物，原因是

，在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是

。DNA聚合酶只能特异地复制处于

之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了

轮的DNA复制。(4)目的基因能被准确扩增的原因是

。DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增两个引物从子链的5′端向3′端延伸5目的基因独特的双螺旋结构提供了精确的复制模板；碱基互补配对原则保证复制准确的进行

(2n+1-2)=62(5)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三条件，即液体环境、适宜的__________和_________，前者由________

自动调控，后者则靠___________来维持。（6）从理论上讲，在PCR技术中，循环4次产生的DNA分子中，第四次循环产物中含有引物A（或B）的DNA片段所占的比例为

。（7）假设DNA片段有200个脱氧核苷酸对，经PCR扩增后，从理论上计算，除需要引物14个外（注：每个引物中含有20个脱氧核苷酸），还需要游离的脱氧核苷酸

个。（8）在第_______轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。温度PH值PCR扩增仪

缓冲液15/162520(2n-1)400-20×14三5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’思考：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？①n代后，DNA分子有_____个②n代后，DNA链有_____条③n代后，含引物的DNA分子有_____个④n代后，共消耗_____个引物⑤n代后，完整的目的基因有_____个2n2n+12n2n+1-22n-2n用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如下图所示，X为某限制酶识别序列。扩增得到的绝大部分DNA片段是图A-D中的（）

D

PCR反应过程完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳DNA混合物－最长最短琼脂糖凝胶电泳梳子模具根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液，一般配置质量体积比为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。1将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。2待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。3点样孔电泳槽样品将电泳缓冲液加入电泳槽中，电容缓冲液没过凝胶1mm为宜。4将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。5接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为

1∼5V/cm2。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。6取出凝胶，至于紫外灯下观察和照相。702目的基因：控制表达所需性状（必须插到启动子和终止子之间）启动子：本质：特殊序列结构的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA复制原点：DNA复制的起始位点（容易与引物结合）终止子：本质：特殊序列结构的DNA片段位置：基因的下游功能：终止转录标记基因：便于重组DNA分子的筛选。第二步：基因表达载体的构建——核心步骤如：诱导型启动子、组织特异性启动子四环素抗性基因、荧光蛋白基因等载体≠表达载体：相同点：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。区别：表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。目的：确保目的基因在受体细胞中稳定存在和表达，并且能遗传给下一代。辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”启动子与终止子位于DNA分子中，作用：起始和终止转录过程。启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中，作用：起始和终止翻译过程。【思考1】如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？双酶切-G-CTTAA-A-TCTAG【思考2】基因的反向连接导致目的基因不能正常表达2.受体细胞的选择：①转基因植物用

；②转基因动物用

(一般不能用体细胞)；

原因是：

。③微生物常用

等。微生物作为受体细胞的优点是

。④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等则受体细胞为

，原因是

；⑤一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是

。真核细胞分泌蛋白等需内质网、高尔基体等的加工受精卵有发育的全能性无核，无器，不能合成蛋白质体细胞(叶、芽、根)或受精卵受精卵细菌单细胞，繁殖快；遗传物质相对较少，易于培养操作第三步：将目的基因导入受体细胞（转化）1.转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。

3.转化的方法：导入植物细胞导入动物细胞导入原核细胞花粉管通道法、农杆菌转化法显微注射法、病毒介导法Ca2+处理法（感受态法）第三步：将目的基因导入受体细胞（转化）②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；花粉管通道法导入外源DNA适用生物：开花植物（1）花粉管通道法（我国独创）1.目的基因导入植物细胞（2）农杆菌转化法农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。（可转移的DNA）农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。1.目的基因导入植物细胞47（2）农杆菌转化法目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入侵染插入表达1.目的基因导入植物细胞重点剖析1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？

得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养2.将目的基因导入动物细胞操作程序：取受精卵显微注射胚胎移植为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？提纯基因表达载体①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。(1)显微注射法

科学家也用病毒DNA

与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。2.将目的基因导入动物细胞(2)病毒介导法3.将目的基因导入原核生物细胞Ca2+转化法感受态细胞：使用Ca