第五章基因表达调控

第五章基因表达调控

(ControlofGeneExpression)当前1页，总共114页。3/26/20231Outline：第一节基因表达调控概述第二节原核生物基因表达调控第三节真核生物基因表达调控第四节酵母双杂交系统及其发展当前2页，总共114页。3/26/20232第一节基因表达调控概述（Introduction）当前3页，总共114页。3/26/20233a)原核生物对环境的适应，相关的应答真核生物的细胞分化,组织特化,个体发育以及环境对个体表型的影响都是基因表达的结果基因表达的调控涉及RNA转录的开/关，数量，选择性加工蛋白质翻译速率，数量，加工与降解和分泌…当前4页，总共114页。3/26/20234原核生物与真核生物基因表达调控机制具有惊人的相似性共同的起源与共同的分子基础调控机理上调控层次上核酸分子间的互作核酸与蛋白质分子间的互作蛋白质分子间的互作GenomelevelTranscriptionallevelPost-transcriptionallevelTranslationallevelPost-translationallevel当前5页，总共114页。3/26/20235转录水平上的调控是最为经济,灵活，又是最为重要，复杂的调控●在复杂的基因组内，确定需要基因转录的起始位点●精细调节基因表达的水平,以保证生物体对环境的适应●cisfactor&transfactor间严格而又灵活的互作●保证RNApolymerase的进行式转录（不中断，准确终止）当前6页，总共114页。3/26/20236e)生物遗传信息的概念C>cGenomeDNA10%;结构基因的编码序列tripletcodon90%;重复，间隔，调节序列…基因选择性表达指令重要的遗传信息遗传信息的两大类别II类；特定DNAseq.+特定蛋白质/核酸结合基因表达的指令geneon/offI类；DNAseq.RNAseq.(codon)teinphenotype(centraldogma)当前7页，总共114页。3/26/20237f)遗传信息表达的方式组成型表达（constitutiveexpression）Housekeepinggene诱导型表达（inducibleexpression）Luxurygene顺、反因子间互作方式的基因表达调控当前8页，总共114页。3/26/20238第二节原核生物基因表达调控

当前9页，总共114页。3/26/20239Fig,6-30当前10页，总共114页。3/26/202310没有调控蛋白时，RNA聚合酶只是微弱地结合在启动子，导致基因的本底水平表达（basallevelexpression)。这种情况下，RNA聚合酶的结合是限速步骤。当前11页，总共114页。3/26/202311一原核生物转录调控的原理基因表达由调控蛋白控制调控蛋白分为两类： 正调控蛋白或活化子（activator,激活物） 负调控蛋白或抑制子（repressor,阻遏物）通常都是DNA结合蛋白，识别受其控制的基因上的或基因附近的特异位点活化子增强受调控基因的转录，抑制子降低或消除相应基因的转录当前12页，总共114页。3/26/202312二原核生物基因表达调控的层次转录起始的调控转录起始后的调控抗终止作用及其延续远程激活和DNA环化协同结合和变构及信号整合当前13页，总共114页。3/26/202313（一）转录起始调控

--协助RNA聚合酶结合DNA的活化子

阻碍两者结合的抑制子很多原核启动子采用上述方式抑制子结合到与聚合酶结合区相重叠的位点，阻碍聚合酶结合到启动子上来阻止转录

操作子（operator):DNA上抑制子结合的位点活化子协助聚合酶结合到启动子上来激活该启动子开始转录；“黏合”作用当前14页，总共114页。3/26/202314图16-1通过募集RNA聚合酶激活转录当前15页，总共114页。3/26/202315Operoncontrol（操纵元/操纵子调控）

--1971,Jacob.&Monod.当前16页，总共114页。3/26/202316a)操纵子的概念（operonconcept）●控制某一代谢途径的相关基因,紧密连锁地排列在一起,受同一启动子和操作子控制，例:乳糖操纵子LacoperonIpoZYA当前17页，总共114页。3/26/202317结构基因lacZ

β-galactosidase 分解乳糖为半乳糖和 葡萄糖7-2lacY galactosidepermease 转移乳糖进入 细胞lacA galactosidetransacetylase消除同时被 转入的硫代半乳糖苷对细胞造成的毒性调节序列Ogene operator 操作子／操纵基因P promoter 启动子CAP-bindingsite调控蛋白lacI repressor 抑制子／阻遏物CAP 活化子Lacoperon乳糖操纵子／操纵元当前18页，总共114页。3/26/202318当前19页，总共114页。3/26/202319图16-8lac操纵子的控制区域当前20页，总共114页。3/26/202320乳糖操纵子的负控制（negativecontrol）:

阻遏物使操纵元表达关闭。别构蛋白（allostericprotein）：效应分子（也叫诱导物，inducer，effector)与别构蛋白结合后能改变蛋白的远端位点从而改变别构蛋白与第二个配体的结合当前21页，总共114页。3/26/202321对乳糖操纵元来说，直接诱导物是异乳糖（allolactose）当前22页，总共114页。3/26/202322图5-25Lac阻遏蛋白的变构改变。阻遏物为四聚体，155kD是别构蛋白，有DNA结合、蛋白质多聚及诱导物结合结构域等。N-端（1-49aa)是helix-turn-helixDNA结合结构域，由铰链区与核心结构域相连，诱导物结合于核心结构域中心

当前23页，总共114页。3/26/202323培养基中无乳糖：repressionlacI表达生成repressor，以四聚体结合于Operator上，阻止RNA聚合酶转录lacZ、lacY、lacA当前24页，总共114页。3/26/202324当前25页，总共114页。3/26/202325---负控制调控机理Inducer(异乳糖)与repressor特异结合tetramer变构

特异结合力下降1000X作用于O

位点上的repressor变构脱离O位作用于游离的repressor

operononrepressortetramer与operator发生特异结合operonoff

变构失去结合于O位的能力当前26页，总共114页。3/26/202326抑制机理：阻遏物阻止RNA聚合酶与启动子结合，3个操作子，一主二副当前27页，总共114页。3/26/202327图16-13lac抑制子以四聚体结合到两个操作子当前28页，总共114页。3/26/202328当前29页，总共114页。3/26/202329远程作用和DNA环化有些互作蛋白的结合位点在DNA上相距较远（几百—几kb)通过DNA环化使互作蛋白靠近当前30页，总共114页。3/26/202330DNA弯曲蛋白的作用当前31页，总共114页。3/26/202331Lacoperon正控制（positivecontrol）

当只有乳糖存在：在乳糖操纵子中，即使有诱导物存在将阻遏蛋白中和，操纵子的正常表达还必须有一个正调控信号，即cAMP-CAP复合物.

当前32页，总共114页。3/26/202332cAMP能感受葡萄糖的浓度，当葡萄糖的浓度下降，cAMP浓度上升，cAMP与其结合蛋白CAP共同起激活操纵元表达的作用

CAP—cataboliteactivatorprotein降解物激活蛋白orcyclic-AMPreceptorprotein(CRP)genecrp，具有激活表面和DNA结合表面当前33页，总共114页。3/26/202333当前34页，总共114页。3/26/202334cAMP-CAP正控制作用机制：cAMP-CAP二聚体结合于启动子附近的激活位点上，帮助RNA聚合酶结合到启动子上，lac启动子没有UP元件7-17激活位点（activatorsite）：位于转录起始位点上游约60bp处，TGTGA序列7-16

依赖于cAMP-CAP的都是弱启动子，如lac,gal,araoperons当前35页，总共114页。3/26/202335当前36页，总共114页。3/26/202336活化子真的只具有募集聚合酶到基因上的功能吗？试验一：前提:蛋白X和蛋白Y可以互作；用蛋白X取代α-CTD，用蛋白Y与CAP上的DNA结合结构域融合；结果：转录激活试验二：用CAP上的DNA结合结构域取代α-CTD；结果：转录激活当前37页，总共114页。3/26/202337框16-2图1两个活化子旁路实验当前38页，总共114页。3/26/202338图16-11具有螺旋-转折-螺旋结构域的蛋白质结合DNACAP和LacI抑制子都具有helix-turn-helix(螺旋-转折-螺旋)结构域，用来结合DNA，这也是大多细菌调控蛋白识别DNA的机制一个是识别螺旋(Recognitionhelix)，进入DNA的大沟，第二个螺旋横跨大沟与DNA主链联系，以保证识别螺旋出现在正确的位置，并增加整个DNA-蛋白质互作的稳定性当前39页，总共114页。3/26/202339图16-12操作子大沟处λ抑制子和碱基对之间的氢键例外:P22噬菌体的Arc抑制子以两个反平行的β链识别大沟当前40页，总共114页。3/26/202340lac操纵子的表达调控有乳糖和葡萄糖时，操纵子关闭有葡萄糖而没有乳糖时，操纵子关闭没有乳糖也没有葡萄糖时，操纵子关闭没有葡萄糖而只有有乳糖时，操纵子开放→是在正负两个调控体系共同作用下实现的当前41页，总共114页。3/26/202341--以变构而非募集的转录激活例1：NtrC-控制参与氮代谢的基因的表达，如glnA。RNA聚合酶预先结合在启动子上，形成稳定的封闭复合物；活化子NtrC诱导RNA聚合酶产生构象改变，促使封闭复合物转变为开放复合物。当前42页，总共114页。3/26/202342当前43页，总共114页。3/26/202343例2：MerR--控制MerT基因，活化子的变构效应施加在DNA上MerT基因编码一种酶，使细胞对汞毒害抗性增加MerT启动子的-10和-35序列之间是19bp，导致这两个被σ因子识别的序列既不能最佳间隔也不能平行排列当前44页，总共114页。3/26/202344图16-16由MerR激活无Hg2+时，MerR结合于启动子的一个位点上，锁定了启动子，虽然RNA聚合酶仍然能结合，却不能启动有Hg2+时，MerR结合了Hg2+后构象变化，引起启动子中心的DNA扭曲，刚好使-10和-35序列之间采取强启动子的分布方式，此时RNA聚合酶可以起始转录当前45页，总共114页。3/26/202345图16-17像merT样的启动子结构当前46页，总共114页。3/26/202346转录起始后的调控基因调控并不局限于转录起始调控转录提前终止转录延长RNA加工翻译当前47页，总共114页。3/26/202347Negative—repressibleoperon(合成酶类)tryptophansynthetaseoperonIgeneinactiverepressor不活跃的阻遏物Co-repressor(tryptophan)辅阻遏物例子：色氨酸操纵子trpoperon（trip)当前48页，总共114页。3/26/202348trpoperon结构(E.coli)TrpE-A 色氨酸合成途径的5个相关酶Attenuator 弱化子，衰减子trpL leader

trpR repressor 阻遏物O operator 操作子，位于启 动子中P promoter 启动子RPOleadingseq.EDCBAAttenuator当前49页，总共114页。3/26/202349粗调机制这些基因只有在色氨酸缺乏时才被有效表达，由抑制子控制控制抑制子活性的配体（色氨酸）不是诱导物(inducer)，而是辅抑制子/辅阻遏物（co-repressor)当色氨酸浓度高时，与抑制子结合，诱导抑制子构象变化，使其结合操作子并阻止转录当色氨酸浓度低时，抑制子退出操作子，使其允许附近的启动子开始转录当前50页，总共114页。3/26/202350事实上，即使能够起始转录，也常常有许多mRNA被提前终止WHY？当前51页，总共114页。3/26/202351细调--衰减控制（Attenuatorcontrol）用另一个机制确认细胞中已经启动的转录是否继续下去，这种调控机制就是衰减作用（attenuation)。当色氨酸浓度高时，已经开始转录的RNA聚合酶在特异的位点暂停，接着在到达trpE之前终止当色氨酸缺乏时，RNA聚合酶不终止，而是通读trp全部基因衰减作用依赖于细菌中转录和翻译的耦联，以及RNA分子内碱基配对形成可变结构的能力当前52页，总共114页。3/26/202352trpoperon的5’端结构分析从色氨酸启动子到trpE的第一个密码子之前的序列可以转录出161个核苷酸的RNA，叫做leadersequence，能形成典型的发夹结构leadersequence的3’末端之前有一个转录终止子，反向重复序列和一串8个U，色氨酸大量存在时，转录通常会在此停止，产生139nt的前导RNA当前53页，总共114页。3/26/202353当前54页，总共114页。3/26/202354图16-19trp操纵子当前55页，总共114页。3/26/202355leadersequence包括一个小的ORF，编码14aa的短肽，ORF前有核糖体强结合位点14aa的短肽有连续2个色氨酸当前56页，总共114页。3/26/202356当前57页，总共114页。3/26/202357mRNA前导区序列分析：序列内有4个片段：分别用1、2、3和4表示4个片段能以两种不同的方式进行碱基配对：1-2和3-4配对2-3方式配对当前58页，总共114页。3/26/2023581区和2区互补3区和4区互补2区和3区互补阻止1和2、3和4配对典型终止子结构当前59页，总共114页。3/26/202359当色氨酸足够时，色氨酰－tRNATrp就多，核糖体顺利通过色氨酸密码子处，当核糖体占据1和2区时，刚转录出来的3和4区配对形成终止子发夹，转录提前停止当色氨酸缺乏时，色氨酰－tRNATrp就少，核糖体到达色氨酸密码子处不得不停下来，此时色氨酸密码子周围的RNA在核糖体内，屏蔽了1区，使2和3区优先配对，不能形成终止子发夹（3和4区）。而RNA聚合酶能通过衰减子，转录trp基因当前60页，总共114页。3/26/2023607-36当前61页，总共114页。3/26/2023617-33类似不依赖ρ因子的终止方式？！当前62页，总共114页。3/26/202362Trpoperon启动子较弱，控制不完全，70Xattenuator提供另外10倍的控制当前63页，总共114页。3/26/202363Attenuatorcontrol的生物学意义原核生物细致的精细调控机制增强原核生物对环境的适应性当有少量trp存在repressor不足以关闭operon当有大量trp存在少量RNApol通过O位点只要细胞内有trp-tRNAtrp存在Attenuator就会使RNApol在前导区转录中断当前64页，总共114页。3/26/202364同样靠衰减控制的亮氨酸操纵子先导序列有4个邻近的亮氨酸密码子；组氨酸操纵子先导序列有7个连续的组氨酸密码子当前65页，总共114页。3/26/202365表16-1衰减子控制的操纵子的先导肽包括氨基酸合成的基因*当前66页，总共114页。3/26/202366图16-22E.coli核糖体蛋白操纵子翻译起始调控的例子：核糖体蛋白抑制自身合成当前67页，总共114页。3/26/202367在核糖体大亚基上，L1结合在23SrRNA的一个茎环结构上。当过量L1的表达时，结合于L11起始密码子处的类似结构上，阻止了L11的翻译。L11和L1是连在一起翻译的，所以也抑制了L1自身的翻译，直到过量的L1消失为止当前68页，总共114页。3/26/202368图16-23核糖体蛋白S8结合16SrRNAS8自身抑制的例子相似的茎环结构当前69页，总共114页。3/26/202369第三节真核生物基因表达调控当前70页，总共114页。3/26/202370基因表达调控上的主要异同以转录水平调控为主真核生物染色质的状态对基因表达的调控以positivecontrol为主m5C与基因表达的相关转录后多种方式的加工调节TransF+CisF.Geneon/off相异；相似；个体发育的阶段调控调控机制更复杂、更精细当前71页，总共114页。3/26/202371例：调节序列的差异同典型的细菌相比，大多数真核基因有更多的调节位点并被更多的调节蛋白所控制细菌中，单个调节蛋白与小段序列结合真核细胞中，结合位点数目庞大，位置更加远离转录起始点（启动子上、下游数千核苷酸处）调节序列（regulatorysequence）：一个基因上包含调节蛋白结合位点的集合的DNA延伸部分称做调节序列反映了信号的更加广泛的整合当前72页，总共114页。3/26/202372图17-1

细菌、酵母和人类基因组的调节元件当前73页，总共114页。3/26/202373从酵母到哺乳动物转录调节的保守机制典型的真核细胞活化子的工作方式与细菌相似活化子的DNA结合结构域与激活功能分离真核细胞调节蛋白使用一系列DNA结合结构域，但DNA识别原理与细菌的相同激活结构域不确定当前74页，总共114页。3/26/202374图17-2

Ga14与DNA上位点的结合DNA结合结构域与激活功能也可以位于不同的蛋白上当前75页，总共114页。3/26/202375二真核细胞调节蛋白使用的DNA结合结构域可以分为三类：同型结构域（Homeodomains，HDs)含锌DNA结合域（Zinc-containingmodules）亮氨酸拉链结构域（bZIP/bHLH)当前76页，总共114页。3/26/202376图17-5

同型结构域识别DNA非常类似于细菌的helix-turn-helixDNA结构域识别方式如Gal4由三段α螺旋组成：其中2和3形成类似helix-turn-helix的模式，如Gal4当前77页，总共114页。3/26/202377Zinc-fingerprotein锌指蛋白，两个半胱氨酸和两个组氨酸结合一个锌离子如TFIIIA，含9个锌指当前78页，总共114页。3/26/202378图17-6

锌指结构域DNA由嵌入大沟的α螺旋识别当前79页，总共114页。3/26/202379图17-7亮氨酸拉链结合DNAZIP—Leucinezipper,二聚化结构域b:basicregion，DNA结合结构域DNA由嵌入大沟的basicregion识别两个长的螺旋形成一个钳形结构，将DNA夹于其中当前80页，总共114页。3/26/202380当前81页，总共114页。3/26/202381当前82页，总共114页。3/26/202382图17-8螺旋-环-螺旋模体当前83页，总共114页。3/26/202383激活结构域没有固定的结构，但有些在氨基酸组成上有特点酸性结构域（acidicdomain）如Gal4，49aa中有11个酸性aa富含谷氨酰胺结构域（Glutamine-richdomain）如Sp1的两个结构域含25%的谷氨酰胺富含脯氨酸结构域（Proline-richdomain）如活化子CTF的一个结构域84个aa中有19个脯氨酸当前84页，总共114页。3/26/202384三真核生物活化子通过间接方式募 集RNA聚合酶活化子与转录机器上除RNA聚合酶以外的部分作用，通过募集这些部分来募集聚合酶活化子募集核小体修饰成分改变基因附近染色质的性质，方便RNA聚合酶结合当前85页，总共114页。3/26/202385图17-9在真核细胞中通过募集转录机器来激活转录起始当前86页，总共114页。3/26/202386第一步：TFIID结合于TATA框及其上游序列。第二步：按顺序先后依次加入TFIIA、TFIIB第三步：加入TFIIF/RNA聚合酶II第四步：TFIIE、TFIIH等加入，最后形成基本转录装置。 基本转录装置的形成：当前87页，总共114页。3/26/2023873.TFIIB&RNAPolbindingBindstoTFIIDBindstoRNAPolwithTFIIF（AbridgebetwTFIIDandPol)当前88页，总共114页。3/26/202388通过活化子募集组氨酸乙酰转移酶和核小体重塑分子改变染色质局部结构图17-11通过活化子直接改变染色质局部结构当前89页，总共114页。3/26/202389四远距离控制：DNA环化与绝缘子果蝇cut基因被100kb以外的增强子激活，Chip蛋白在增强子和基因之间有多个结合位点，多个Chip蛋白互作在中间的DNA上形成多个小环，使启动子和增强子接近绝缘子阻碍增强子的作用当前90页，总共114页。3/26/202390图17-12绝缘子阻止增强子的活性当前91页，总共114页。3/26/202391信号整合与组合控制活化子联合作用促进整合信号整合的2个例子组合控制例子当前92页，总共114页。3/26/202392图17-14活化子协同与DNA结合活化子联合作用产生协同效应只有两种作用因子都存在时基因才能有效表达当前93页，总共114页。3/26/202393例子1：酿酒酵母的HO基因 酿酒酵母以出芽的方式分裂，HO基因仅在母细胞内表达，并且只出现在细胞周期特定点活化子SWI5和SBF共同控制其表达SWI5在基因周围离启动子较远处（1kb以上)有多个结合位点，能独立地与位点结合，但是离启动子太远而不能激活HO基因SBF在离启动子很近处有多个结合位点，但是这些位点在染色质中的排列使SBF不能独立与位点结合当前94页，总共114页。3/26/202394SWI5募集核小体修饰物（一种伴随重塑酶SWI/SNF的组蛋白乙酰基转移酶），其在核小体上的作用将暴露SBF结合位点SBF结合到位点后，直接与中介蛋白结合，募集转录机器并激活HO基因表达当前95页，总共114页。3/26/202395图17-15对HO基因的控制当前96页，总共114页。3/26/202396滤过性毒素感染触发了3个活化因子：NFκB、IRF和Jun/ATF人类β干扰素基因启动子上游约1kb处有个增强子，3个活化因子协同与该增强子结合形成增强体（enhanceosome）HMG-1蛋白与增强子结合，使DNA弯曲，方便活化因子间的相互作用例子2：人类β干扰素基因当前97页，总共114页。3/26/202397图17-16人类β信号整合与组合控制干扰素增强体当前98页，总共114页。3/26/202398组合控制体现在真核细胞的复杂性与多样性上图17-17组合控制当前99页，总共114页。3/26/202399五转录抑制子的不同作用方式抑制子结合在与启动子重叠的位点阻断RNA聚合酶结合—竞争（原核多见）抑制子结合在启动子附近，与结合在那里的RNA聚合酶相互作用抑制转录起始—直接阻遏抑制子干扰活化子功能—抑制抑制子募集核小体修饰酶，如组蛋白脱乙酰酶或甲基化酶，使染色质浓缩，或者去除能够被转录机器识别的基团—间接阻遏当前100页，总共114页。3/26/2023100图17-19真核生物抑制子的作用方式当前101页，总共114页。3/26/2023101图17-20酵母GAL1基因的抑制例子：Mig1对酵母GAL基因的控制葡萄糖存在时，Mig1募集“抑制复合体”，包括Tup1蛋白，Tup1蛋白作用假说：1Tup1募集组蛋白脱乙酰酶，后者使邻近的核小体脱乙酰化2Tup1在启动子部位与转录机器直接作用抑制转录这种“抑制复合体”也能被酵母或哺乳动物的其它抑制子所用当前102页，总共114页。3/26/2023102信号对真核细胞的作用方式总结信号影响转录调节子与DNA结