分子生物学第次课周

分子生物学第次课周第1页，共78页，2023年，2月20日，星期四Chap7基因的表达与调控一、影响原核生物基因调控的信号1.营养状况2.环境因素二、原核基因的表达与调控1.转录水平的调控2.转录后水平的调控

mRNA加工水平上的调控翻译水平的调控第2页，共78页，2023年，2月20日，星期四三、原核生物基因调控机制的类型和特点1.正转录调控2.负转录调控正控诱导正控阻遏负控诱导负控阻遏第3页，共78页，2023年，2月20日，星期四正控制系统和负控制系统1负控制系统：在没有调节蛋白质存在时基因表达，加入调节蛋白后基因表达活性被关闭阻遏蛋白：负控制系统中的调节蛋白第4页，共78页，2023年，2月20日，星期四2正控制系统：没有调节蛋白质存在时基因关闭,加入这种调节蛋白质后基因活性被开启诱导蛋白第5页，共78页，2023年，2月20日，星期四第6页，共78页，2023年，2月20日，星期四正控诱导负控诱导正控阻遏负控阻遏调解蛋白激活蛋白阻遏蛋白激活蛋白阻遏蛋白效应分子诱导物诱导物辅阻遏物辅阻遏物调控结果基因转录基因转录阻遏基因转录阻遏基因转录第7页，共78页，2023年，2月20日，星期四7.1.1DiscoveryofOperon

1961年,F.Jacob&J.Monod提出,此后不断完善。获1965年诺贝尔生理学和医学奖1940年，Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生“二次生长曲线”。文献：细胞中存在两种酶，即组成酶与诱导酶1947年，报告：“酶的适应现象及其在细胞分化中的意义”FrancisJacob

JacquesMonod

7.1乳糖操纵元第8页，共78页，2023年，2月20日，星期四1951年，Monod与Jacob合作，发现两对基因：Z基因：与合成β-半乳糖苷酶有关；I基因：决定细胞对诱导物的反应。Szilard：I基因决定阻遏物的合成，当阻遏物存在时，酶无法合成，只有有诱导物存在，才能去掉该阻遏物。

Jacob：结构基因旁有开关基因（操纵基因），阻遏物通过与开关基因的结合，控制结构基因的表达。第9页，共78页，2023年，2月20日，星期四乙酰基转移酶半乳糖苷透性酶ß-半乳糖苷酶操作位点乳糖操纵元结构调节基因第10页，共78页，2023年，2月20日，星期四操纵元是一种完整的具有特定功能的细菌基因表达和调节的单位，包括调节基因，操纵位点，结构基因，组成一个控制单元结构基因：产生mRNA,合成蛋白质操纵位点promotor,operator：启动子结合位点调节基因：产生调节蛋白（与操纵位点结合）→结构基因不转录诱导物存在时，可与阻遏蛋白结合→结构基因转录ControlelementStructuralgenes第11页，共78页，2023年，2月20日，星期四7.1.2酶的诱导现象B-半乳糖苷酶第12页，共78页，2023年，2月20日，星期四分解底物的酶只有在底物存在时才出现！无乳糖时，几个B-gal/cell

加入乳糖时，5000个再去掉乳糖，lacmRNA下降

乳糖能激发lacmRNA的合成

乳糖的诱导作用是由酶前体转化而来，还是诱导新酶合成？培养基（35S-aa,无乳糖）→E.coli繁殖→培养基（无35S-aa,加入乳糖）→β-gal(无35S)第13页，共78页，2023年，2月20日，星期四7.1.3调控机理1调控区结构lacI,1045bp，独立PiP,82bp，－82～＋1O,35bp，－7～＋28lacZYA第14页，共78页，2023年，2月20日，星期四体外结合竞争实验:

阻遏物＋RNApol,off

RNApol＋阻遏物，on2.阻遏状态第15页，共78页，2023年，2月20日，星期四3诱导状态诱导物诱导作用：在可诱导的操纵元中，加入对基因表达有调节作用的小分子后，开启基因的转录活性第16页，共78页，2023年，2月20日，星期四4诱导物不是乳糖生成lac诱导物乳糖代谢Allolctose异构乳糖别乳糖细胞内β-半乳糖苷酶来源?第17页，共78页，2023年，2月20日，星期四gratuitousinducer

安慰诱导物

义务诱导物可诱导半乳糖苷酶产生，但不是其底物IPTG，异丙基半乳糖苷TMG，巯甲基半乳糖苷ONPG,O-硝基半乳糖苷在研究诱导作用时，很少使用乳糖第18页，共78页，2023年，2月20日，星期四7.1.4阻遏蛋白的作用机制1阻遏蛋白结构38KD，4聚体，一个亚基结合一个IPTG分子lacI

组成型转录

Pi弱启动子，

5－10个／cell具有二重性阻止转录（与lacO结合）开始转录（与诱导物结合）第19页，共78页，2023年，2月20日，星期四

对称轴，+11对称序列，6bp

阻遏蛋白的结合位点－－lacO的结构第20页，共78页，2023年，2月20日，星期四3阻遏蛋白对RNApol功能的影响阻遏蛋白和RNApol可同时与DNA结合结合着的RNApol不能转录.但加入诱导物后,释放出阻遏蛋白,变为开放型启动子复合物.阻遏蛋白实际上使RNApol贮存在启动子上。第21页，共78页，2023年，2月20日，星期四+glucose-glucoseTime(hr)Unitsof-galactosidase+lactoseGlucoseadded7.1.5lacoperon的正调控

1代谢物阻遏效应实验，在lac＋Glu培养基上

E.coli只利用G，只有G

耗尽时，才会利用lac葡萄糖抑制lacmRNA的转录：

可阻止诱导物引起的阻遏物失活效应仅去掉阻遏物并不能启动lac基因表达,有其它因素参与第22页，共78页，2023年，2月20日，星期四葡萄糖效应（代谢物阻遏效应）有葡萄糖存在的情况下即使细菌培养基中有乳糖、半乳糖、或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶，这种现象称为葡萄糖效应或降解物抑制作用。第23页，共78页，2023年，2月20日，星期四葡萄糖对lac操纵元表达的抑制是间接的

乳糖的降解是通过cAMP与CAP结合起作用的

cAMP:环化腺苷酸CAP,cataboliteactivatorprotein

由crp编码CRP,catabolitereceptorprotein第24页，共78页，2023年，2月20日，星期四第25页，共78页，2023年，2月20日，星期四2CAP结合位点CAP为二聚体，45KD，被cAMP激活结合位点～22bpI-70~-50II-50~-40第26页，共78页，2023年，2月20日，星期四由于序列的差异，使不同基因受cAMP激活的水平不同结合位点序列保守第27页，共78页，2023年，2月20日，星期四3CAP的结合对DNA构型的影响DNA弯曲弯曲点位于CAP结合位点二重对称的中心弯曲使CAP能与启动子上的RNApol接触第28页，共78页，2023年，2月20日，星期四（1）CAP结合位点与转录起始点的位置CAP与转录起始点的距离，相距数个整双螺旋CAP结合位点在启动子的上下游，都能发挥作用4

CAP对转录的影响第29页，共78页，2023年，2月20日，星期四（2）基因转录对cAMP—CAP系统的依赖性，

与启动子本身的效率有关cAMP-CAP复合物的结合，使位点II附近的富含GC区域双螺旋结构稳定性降低，因而-10区的熔解温度降低，促进开放型启动子复合物的形成第30页，共78页，2023年，2月20日，星期四（3）CAP激活转录的方式CAP直接作用于RNApolα亚基缺失RNApolα亚基的—C末端时，失去受CAP激活的能力作用于DNA，改变其结构第31页，共78页，2023年，2月20日，星期四7.1.6lacoperon的其它问题lacoperon的功能是在正负两个调控体系的协调作用(coordinateregulation)下实现的。阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用；如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白从P上解聚仍无转录活性CAP组成型合成，所以cAMP－CAP复合物取决于cAMP含量cAMP－CAP调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖类代谢有关的酶降解物敏感型操纵元：只要有葡萄糖存在，这些操纵元就不表达

第32页，共78页，2023年，2月20日，星期四2.A基因及其生理功能编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶，使半乳糖苷乙酰化。该酶不参与乳糖代谢！生理意义：在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷类物质，其分解产物不能进一步代谢，积累，抑制细胞生长。半乳糖苷乙酰化后，即无毒.所以lacA虽不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物质的积累3.lac基因产物数量，1：0.5：0.2

不同酶的数量差异,是由于在翻译水平上的调节.方式有二:核糖体脱离:多顺反子的差别性翻译

内切酶作用:在lacmRNA分子内部，a基因比z基因更易受内切酶作用第33页，共78页，2023年，2月20日，星期四Summary第34页，共78页，2023年，2月20日，星期四第35页，共78页，2023年，2月20日，星期四SummaryoflacoperonregulationGlucosecAMPLactoseTranscriptionoflacmRNAHighLowPresentlowrateofexpressionHighLowAbsentessentiallynoneLowHighAbsentessentiallynoneLowHighPresenthighrateofexpression第36页，共78页，2023年，2月20日，星期四8.2Trpoperon生物细胞中的氨基酸合成，也受操纵元的调节。细胞需要某种氨基酸时，其基因即表达，不需要时基因关闭，达到经济的原则。第37页，共78页，2023年，2月20日，星期四trpR,阻遏蛋白P，-40~+18O,-21~+1L,+1~+162结构基因t,A下游36bp,不依赖ρ

t’,t下游250bp，依赖ρ

8.2.1基因组成第38页，共78页，2023年，2月20日，星期四sne298第39页，共78页，2023年，2月20日，星期四7.2.2Trpoperon的阻遏系统1TrpR四聚体第40页，共78页，2023年，2月20日，星期四阻遏蛋白＋trp

→

有活性的阻遏物SNE299trpO→不转录第41页，共78页，2023年，2月20日，星期四2阻遏蛋白的结合位点

trpO-21~+1，反向重复序列trpP-40~+18活性阻遏物与trpO的结合与RNApol与启动子的结合发生竞争SNE299第42页，共78页，2023年，2月20日，星期四3阻遏系统主管转录是否启动，在缺乏Trp时，mRNA起始合成，但不能自动延伸，一般在trpE之前终止转录

粗调开关第43页，共78页，2023年，2月20日，星期四8.2.3弱化作用

attenuation1弱化子，衰减子，α前导RNA，140bpα第44页，共78页，2023年，2月20日，星期四弱化子，衰减子，α第45页，共78页，2023年，2月20日，星期四序列分析发现，前导区其中4个片段进行配对，形成不同的二级结构Terminator第46页，共78页，2023年，2月20日，星期四

S312POE4321LDNARNAATGTGA2trpcodons14322前导肽14aa第47页，共78页，2023年，2月20日，星期四第48页，共78页，2023年，2月20日，星期四3转录弱化作用LackoftrpLackofaminoacyltRNARibosomepauseattrpcodons,occludingsequence1Form2:3hairpinanti-terminator

TranscriptionintotrpEandbeyond第49页，共78页，2023年，2月20日，星期四HightrpTrpisinsertedatthetrpcodonsTranslatetotheendofleadermessageRibosomeoccludesequence2Terminatetranscriptionat(3:4formterminator)第50页，共78页，2023年，2月20日，星期四弱化子对转录调控的关键空间结构，10thand11thcodonsencodetrpresidues(rareAA)时间，核糖体停顿在2个Trp密码子上（1区）时，产生延宕，此时4区转录出来不能与3区配对Theleaderpeptideistodeterminertrpavailabilityandtoregulatetranscriptiontermination14–amino-acid(encodedby27-68oftheleaderRNA）summary第51页，共78页，2023年，2月20日，星期四7.2.4阻遏作用与弱化作用的协调

阻遏效率启动子的转录起始频率在R+和R-相差70倍弱化作用

trp存在时，约有10％的RNApol侥幸转录

-trp

活性阻遏物－－－－→无活性阻遏物

←－－－－

+trptrp操纵子具有双重调节体系？第52页，共78页，2023年，2月20日，星期四Negative—repressibleoperon可以被最终合成产物所阻遏RPOleadingseq.EDCBAtrp+为什么需要阻遏体系？当大量Trp存在时，阻遏系统起作用。阻遏物与之结合，阻止先导mRNA合成。

经济第53页，共78页，2023年，2月20日，星期四仅有少量trp时，RNApol启动，但在L.S.处脱落，转录中断RPOleadingseq.EDCBA少量trp+不足以结合

O

位点为什么需要弱化系统？当trp浓度低时，阻遏物从有活性变为无活性，速度极慢，不能很快引发trp合成。因此需要一个能快速作出反应的系统，以保持培养基中适当的Trp水平。第54页，共78页，2023年，2月20日，星期四7.2.5细菌演化出弱化系统的生物学意义

通过tRNA荷载与否进行调控，更为灵敏氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而tRNA荷载为标准进行调控更为恰当两个调控系统，避免浪费提高效率阻遏系统高水平trp时，不转录低水平trp时，转录至LS

弱化系统细调原核生物细致的精细调控机制增强原核生物对环境的适应性第55页，共78页，2023年，2月20日，星期四第56页，共78页，2023年，2月20日，星期四7.3其他操纵子1.半乳糖操纵子2.阿拉伯糖操纵子3.阻遏蛋白LexA的降解与细菌的SOS应答4.多启动子调控的操纵子第57页，共78页，2023年，2月20日，星期四1.半乳糖操纵子galactoseoperon特点（1）包括三个结构基因，galE（异构酶)galT(乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶）、galK（半乳糖激酶）（2）诱导物为半乳糖（3）有双启动子（4）两个操纵区第58页，共78页，2023年，2月20日，星期四TGTTATGCTATGGTTATTTACAATACGATACCAATAAS2S1-20-10两个重叠的Pribnow无葡萄糖时，S1起始的转录顺利进行cAMP-CRP抑制从S2的转录，诱发S1的转录双启动子的特点：第59页，共78页，2023年，2月20日，星期四双启动子的生理功能半乳糖的功能

1.大肠杆菌细胞壁合成的前体

2.作为唯一碳源供细胞生长UDP-葡萄糖galEUDPgal合成细胞壁过程对异构酶的需要量小第60页，共78页，2023年，2月20日，星期四2、阿拉伯糖操纵子调控机理（具有正负调控双重功能调节蛋白）（1）概述阿拉伯操纵子（Araoperon）的转录起始是有CAP、Arac蛋白，Ara糖是1个可作碳源的5碳糖，和乳糖一样，Ecoli以Ara糖为能源生长时，能产生该糖代谢途径的3种酶催化Ara糖转换成→5磷酸木酮糖→糖酵解途径（磷酸戊糖途径）。（2）Araoperon的结构DNAaraCIO2ParaCIO1BADPBADCAP位点CAmPCAPmRNAProtein(Arac)mRNABADArac-调节蛋白C的编码基因ParcPBAD-启动子IO1O2-调控元件B-L核酮糖激酶（isomerase）A-L阿拉伯糖异构酶（kinase）D-L核酮糖与磷4表异构酶（opimerase）I-起始部位第61页，共78页，2023年，2月20日，星期四②阻遏机理无Ara糖时，认为AraCrep二聚体同时结合araO2、I，将二者拉在一起→形成DNA环状结构，有效阻遏了araBAD的转录。③激活机理有Ara糖时，Ara糖+AraC→去阻遏，同时cAMP-CAP结合CAP位点→促进araBAD和arac的转录。当araC表达过多时↑→Cind结合O1，阻碍了C的表达。若有足够的araBAD酶产出，则Cind减少或消失，这样BAD基因关闭。第62页，共78页，2023年，2月20日，星期四3.阻遏蛋白LexA的降解与细菌的SOS应答（1）参与SOSDNA修复系统的许多基因分散在染色体的不同部位（2）SOSDNA修复系统的许多基因受LexA阻遏蛋白的抑制（3）recA在细胞中本底表达（4）DNA复制严重受损时，RecA与缺口单链DNA结合被激活成蛋白酶，时LexA蛋白失去活性，导致SOS体系的高效表达SOS是细胞DNA复制受损或复制系统受到抑制的紧急情况，为求得生存而做出的应急反应。第63页，共78页，2023年，2月20日，星期四1.SOS诱导与DNA修复有关的酶产生，加强细胞的修复能力2.SOS诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，虽然避免了死亡，却带来了很高的突变3.SOS抑制细胞分裂，因为DNA复制受到抑制，避免因细胞分裂而产生的变异率4.SOS由RecA和LexA相互作用引起的，RecA是SOS最初的发动因子，RecA能被单链DNA和ATP激活5.SOS包括DNA修复和导致变异6.多数能诱导产生SOS反应的作用剂对高能生物都是致癌的，如：X射线、紫外线和烷化剂第64页，共78页，2023年，2月20日，星期四4.多启动子控制的操纵子（1）rRNA操纵子，p1,p2两个启动子（2）核糖体蛋白SI操纵子4个启动子（3）DnaQ蛋白有弱启动子和强启动子DNA聚合酶的亚基，校正复制过程中可能出现的错误，受RNA聚合酶的调控第65页，共78页，2023年，2月20日，星期四原核生物的转录后调控1．翻译起始的调控２．稀有密码子对翻译的调控３．重叠基因对翻译的调控４．ＰｏｌｙＡ对翻译的影响５．蛋白质对翻译的影响６．魔斑水平对翻译的影响第66页，共78页，2023年，2月20日，星期四

翻译起始的调控ＲＢＳ为ｍＲＮＡ上核糖体结合位点ＲＢＳ中有ＳＤ序列能与核糖体上１６ＳｒＲＮＡ３‘端互补配对。有利于翻译的起始，SD与AUG之间一般为4-10个核苷酸，9个核苷酸为最佳2.SD序列的变化改变了5’端自由能，影响了核糖体小亚基与ｍＲＮＡ的结合，导致表达效率成百上千的差异第67页，共78页，2023年，2月20日，星期四稀有密码子对翻译的调控dnaG基因编码DNA复制过程中的引物酶2.dnaG、rpoD及rpsU位于同一个操纵子中，但三个基因产物在数量上有较大差异3.50个dnaG蛋白，2800个rpoD蛋白，4000个rpsU蛋白第68页，共78页，2023年，2月20日，星期四重叠基因对翻译的影响1.Trp操纵子有E、D、C、B、A五个基因组成2.E的终止子密码子和D基因的起始密码子共用一个核苷酸3.E----苏氨酸-----本丙氨酸--------终止

ACU----------UUC------------UGA-------UGG—CUAUG----------GCU

甲硫氨酸-----丙氨酸-----trpD4.trpB-----谷氨酸----异亮氨酸------终止

GAA----AUG------------UGA------------UGG------AAAUG----------GAA

甲硫氨酸-----谷氨酸-----trpA第69页，共78页，2023年，2月20日，星期四polyA对翻译的影响蛋白质合成旺盛，mRNA上核糖体数量多，mRNA链上polyA较长，mRNA不在翻译时，其尾巴相应缩短粘菌在营养充足时以营养生长为主，此时mRNA上核糖体数量较多在营养不足是以发育生长为主，此时核糖体数量较少。第70页，共78页，2023年，2月20日，星期四蛋白质对翻译的影响蛋白质能阻遏或激活转录蛋白质能在翻译水平上调节基因表达Qß噬菌体有三个基因吸附蛋白外壳蛋白RNA复制酶噬菌体进入细胞后，以此RNA为模板指导合成复制酶，复制酶行使复制功能但RNA上有许多核糖体，影响了复制酶催化作用复制酶作为翻译阻遏物调节基因表达第71页，共78页，2023年，2月20日，星期四魔斑对翻译的基因表达的