心房纤颤患者血栓前状态及心房电重构的实验研究

心房纤颤患者血栓前状态及心房电重构的实验研究第1页/共70页心房纤颤患者血栓前状态及

心房电重构的实验研究第2页/共70页前

言第3页/共70页前

言心房纤颤是常见的心律失常

房颤并发的以缺血性脑卒中为主的血栓栓塞严重危害人类健康和生命血栓前状态（PTS）作为一种重要的临床现象近年来受到国内外学者的广泛关注及时识别PTS，确定房颤患者中的高危人群，将有助于预防和减少栓塞事件的发生第4页/共70页

本研究提出房颤患者的PTS，并通过检测房颤患血浆中PTS分子标志物的水平，探讨房颤患者PTS的形成机制，寻找评估房颤患者栓塞危险性的新手段，以指导抗凝治疗。前

言第5页/共70页心房纤颤具有自身延续性，慢性房颤的发生与维持似乎与房颤本身有关。据此，Allessie等提出了房颤引发房颤的观点。在房颤的持续过程中，房颤本身可导致心房电生理学特性的变化，即心房电重构（AER）。研究表明，在AER中心房肌细胞内钙超负荷起了重要作用肌浆网钙泵在调控细胞内Ca2+浓度方面起决定作用前

言第6页/共70页

本研究采用RT-PCR方法，通过在分子生物学水平测定心房肌细胞肌浆网Ca2+-ATPase的mRNA表达，探讨房颤患者AER的机制，以加深对房颤本质的认识，从而使房颤预防和治疗的新的方法成为可能。

前

言第7页/共70页第一部分房颤患者血浆中PTS分子标志物的测定

第8页/共70页材料与方法第9页/共70页一、研究对象及分组情况

1.房颤组：共29例，男17例，女12例。年龄39—78（62.4±10.5）岁，为我院住院或急诊留观的非瓣膜病Af患者。Af由多次ECG诊断。根据Af性质又分为：1.1持续房颤组：18例。年龄39—79（64.1±11.0）岁，Af发作持续时间均≥3个月。1.2阵发房颤组：11例。年龄42—74（59.6±9.5）岁，均在Af发作期，且发作时间均≥48小时。2.对照组：共26例，男16例，女10例。年龄45—85（60.9±11.8）岁，均为窦性心律者。（1）第10页/共70页房颤组与对照组的所有入选对象均除外心绞痛、心肌梗塞，心电图及Holter均未见缺血性改变。无明显高脂血症、无糖尿病、脑梗塞、心功能不全及肿瘤。房颤组有11人服抗凝药，为巴米尔0.1Qd或抵克利得0.25Qd，对照组均未服用抗凝药。一、研究对象及分组情况

（2）第11页/共70页二、主要设备及制剂

（1）1.主要仪器、设备流式细胞仪美国Becton-Dickinson公司酶标仪美国光度计美国恒温水浴箱上海医疗器械厂水平混合器江西医疗器械厂50—200μl八通道加样器100—200μl，10、25、50、100、500μl加样器第12页/共70页2.试剂CD61抗体美国Becton-Dickinson公司PAC-1抗体美国Becton-Dickinson公司鼠IgM美国Becton-Dickinson公司FITC荧光染料美国Becton-Dickinson公司1%多聚甲醛血栓调节蛋白ELISA法试剂盒美国ADI公司牛血清白蛋白（BSA）美国Sigma公司0.5MH2SO4酶标TAT微孔板美国D-二聚体ELISA法测定试剂盒美国

二、主要设备及制剂

（2）第13页/共70页三、实验方法血浆血小板膜糖蛋白(GPIIb/IIIa)水平的测定——全血法流式细胞术标本制备：粗针头取空腹静脉血2.7ml，3.8%枸橼酸钠抗凝。对照管及测定管各加血5l，然后各加CD6110l。测定管中加PAC-110l，对照管加鼠IgM10l，混匀。避光20分钟。1%多聚甲醛1ml固定。测定：用流式细胞仪检测样本。检测结果用特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率，即GPIIb/IIIa阳性血小板的百分数表示。第14页/共70页血浆血栓调节蛋白（TM）水平的测定

——ELISA法

血浆凝血酶-抗凝血酶III复合物（TAT）的测定——ELISA法血浆二聚体D（D-dimer）的测定——ELISA法

三、实验方法第15页/共70页TM标准曲线Y=0.55+0.64lnX第16页/共70页TAT标准曲线Y=0.18+0.02X第17页/共70页D-dimer标准曲线Y=0.175+0.002X第18页/共70页统计学处理应用SPSSForWindows8.0软件，数据以均数±标准差表示，各组数据分别进行独立样本t检验，方差分析，单变量相关分析，回归分析等统计学方法。取<0.05为统计学差异有显著性。第19页/共70页结

果第20页/共70页

入选对象共55人，其中房颤组29人，对照阻26人。房颤组又分为：持续房颤组18人，阵发房颤组11人。入选者的一般情况第21页/共70页*房颤组vs对照组P>0.05对照组房颤组

年龄男/女（总计）收缩压(mmHg)舒张压（mmHg）60.92±11.7916/10（26）123.27±12.2471.54±8.6962.41±10.52*17/12（29）127.24±13.47*74.48±9.39*入选者的一般情况第22页/共70页

房颤组GPIIb/IIIa测得值明显高于对照组，差

别具有高度统计学意义(P<0.01)

房颤患者血浆GPIIb/IIIa的变化对照组(n=26)房颤组(n=29)GPIIb/IIIa（%）8.35±6.29

23.98±14.61*

表2.房颤组与对照组GPIIb/IIIa比较*房颤组与对照组相比P<0.01第23页/共70页房颤组与对照组血浆GPIIb/IIIa比较第24页/共70页持续房颤组的GPIIb/IIIa水平明显高于阵发房颤组，差别有高度显著性(P<0.01)，

房颤患者血浆GPIIb/IIIa的变化阵发房颤组(n=11)持续房颤组(n=18)GPIIb/IIIa（%）14.22±8.51

29.95±14.48*表3.持续房颤组与阵发房颤组GPIIb/IIIa比较

*持续房颤组与阵发房颤组相比P<0.01第25页/共70页持续房颤组与阵发房颤组GPIIb/IIIa比较第26页/共70页各组之间GPIIb/IIIa比较第27页/共70页房颤时间与GPIIb/IIIa水平的相关性第28页/共70页房颤患者血浆TM水平的变化

对照组（n=26）房颤组（n=29）TM(ng/ml)）1.05±0.21

1.41±0.32*

表4.房颤组与对照组血浆TM水平比较

*房颤组与对照组相比P<0.01与对照组相比，房颤组的血浆TM水平显著升高，两者差别有统计学意义(P<0.01)第29页/共70页房颤组与对照组血浆TM水平比较第30页/共70页房颤患者血浆TM水平的变化

对照组（n=11）阵发房颤组

（n=18）TM(ng/ml)）

1.22±0.20

1.53±0.32*

表5.持续房颤组与阵发房颤组血浆TM比较

*持续房颤组与阵发房颤组相比P<0.01持续房颤组的TM水平高于阵发房颤组，差异有显著性(P<0.01)第31页/共70页持续房颤组与阵发房颤组TM比较第32页/共70页房颤患者血浆TM水平的变化

对照组（n=26）阵发房颤组

（n=11）TM(ng/ml)1.05±0.21

1.22±0.20*

表6.阵发房颤组与对照组血浆TM水平比较

*持续房颤组与阵发房颤组相比P<0.01阵发房颤组的TM水平较对照组高，差别有统计学意义(P<0.05)第33页/共70页各组之间血浆TM水平比较第34页/共70页对照组（n=26）房颤组

（n=29）TAT（μg/L）8.62±3.71

12.46±6.66*

表7.房颤组与对照组血浆TAT水平比较

*房颤组与对照组比P<0.05房颤患者的血浆TAT水平比对照组有所升高，二者差别有显著性(P<0.05)房颤患者血浆TAT水平的变化第35页/共70页房颤组与对照组血浆TAT水平比较第36页/共70页阵发房颤组(n=11)持续房颤组(n=18)TAT（μg/L）11.35±5.21

13.13±7.47*

表8.持续房颤与阵发房颤组血浆TAT比较

*持续房颤与阵发房颤组比P>0.05持续房颤组与阵发房颤组比较，其TAT值无显著差异(P>0.05)房颤患者血浆TAT水平的变化第37页/共70页对照组(n=26)阵发房颤组(n=11)TAT（μg/L）8.62±3.71

11.35±5.21*

表9.阵发房颤组与对照组TAT水平比较*阵发房颤组与对照组比P>0.05阵发房颤组与对照组相比，血浆TAT水平高于对照组，但差异无显著性(P>0.05)房颤患者血浆TAT水平的变化第38页/共70页各组之间血浆TAT水平比较#&*#P<0.05*P>0.05&P<0.05第39页/共70页对照组(n=16)房颤组(n=27)D-dimer(mg/L)142.44±113.10222.30±140.03*

表10.房颤组与对照组血浆D-dimer水平比较*房颤组与对照组相比P>0.05房颤组与对照组相比，血浆D-dimer水平升高，但二者差异无统计学意义(P=0.06)房颤患者血浆D-dimer的变化第40页/共70页房颤组与对照组血浆D-dimer比较**P>0.05第41页/共70页对照组(n=16)持续房颤组(n=17)D-dimer(mg/L)142.44±113.10

246.44±155.74*

表11.持续房颤组与对照组血浆D-dimer水平比较*持续房颤组与对照组相比P<0.05持续房颤组血浆D-dimer水平比对照组明显升高，差别具有显著性（P<0.05）房颤患者血浆D-dimer的变化第42页/共70页持续房颤组与对照组血浆D-dimer比较第43页/共70页对照组(n=16)阵发房颤(n=10)持续房颤组(n=10)D-dimer(mg/L)142.44±113.10

181.26±102.72

246.44±155.74*

表12.各组血浆D-dimer水平比较*阵发房颤组与对照组相比P>0.05#持续房颤组与阵发房颤组相比P>0.05持续房颤组的D-dimer水平较阵发房颤组高，但差别无显著性(P>0.05)；阵发房颤组的血浆D-dimer水平较对照组高，但差别亦无显著性(P>0.05)房颤患者血浆D-dimer的变化第44页/共70页各组之间血浆D-dimer水平比较第45页/共70页房颤患者心房心肌细胞肌浆网Ca2+-ATPasemRNA的基因表达

第二部分第46页/共70页材料和方法

第47页/共70页入选者均为我院及安贞医院心外科行换瓣术和冠脉搭桥术的病人，共28例。标本于术中取材于心房或心耳组织。根据有无房颤分为：1.房颤组：15人，其中男9人，女6人。年龄35—67(48.13±8.07)岁，均为持续房颤患者，且房颤持续时间均>3个月。2.对照组：13人，其中男8人，女5人。年龄34—67(51.08±11.89)岁，均为窦性心律者，且既往无心律失常病史。两组之间年龄、性别无显著差异（P>0.05）。病人来源及分组第48页/共70页高速恒温离心机RC5C德国Dupont公司低温离心机J6-B美国Beckman公司UV-2100紫外分光光度计日本岛津公司PE2400PCR仪美国激光图像分析仪瑞典Pharmacia公司电泳仪北京科普仪器厂10μl、20μl、200μl及1000μl加样器主要设备第49页/共70页异硫氰酸胍（GuanidineThiocyanate）GiBCO公司十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）美国Sigma公司ß-巯基乙醇美国Sigma公司重蒸酚岳泰公司逆转录酶（M-MLV）美国Promega公司dNTPs美国Promega公司随机引物美国Promega公司焦碳酸二乙酯（DEPC）美国Sigma公司Taq聚合酶华美公司TaqⅠ(BufferE)华美公司其余均为国产分析纯试剂、药品第50页/共70页实验方法RT-PCR第51页/共70页实验步骤反应过程：RNA2μg随机引物2μl70℃反应5分钟后立即将管取出并置于冰浴中，加入以下试剂：5×转录酶缓冲液5μldNTP(10mM)1.25μlM-MLV(200u/μl)1μl

加DEPC水至总体积25μl混匀后于37℃逆转录反应1小时。75℃反应10分钟使酶灭活。一步法提取总RNARNA逆转录第52页/共70页PCR（1）引物序列肌浆网Ca2+-ATPase：正义链5’

TTGCATTGCAGTCTGGATCA反义链5’

TCCAAAGCAGAGTCATTACA合成片段长度为477bpß-actin（对照）：正义连5’

ATCTGGCACCACACCTTC反义链5’

GCCAGGTCCAGACGCA合成片段长度288bp第53页/共70页PCR（2）反应体系（50μl）10×聚合酶缓冲液5μldNTP(10mM)1μl引物（ß-actin、Ca2+-ATPase）上游12.5pmol

下游12.5pmolDNA1μlTaq酶(3u/μl)0.5μl

加水至总体积50μl第54页/共70页PCR（3）反应条件及循环参数94℃×5min→94℃×30s→57℃×30s→72℃×45s→72℃×7min

30cyclesPCR产物行电泳及染色后采用激光图像分析仪测定条带积分光密度（IOD）第55页/共70页统计学分析采用SPSSForWindows8.0统计学软件，数据均以均数±标准差表示，各组数据按样本性质分别进行t检验，方差分析等，取P<0.05为有统计学差异。第56页/共70页结

果第57页/共70页

房颤组房颤时间均大于3个月，对照组均为窦性心律者，且既往无心律失常史。

对照组

房颤组

年龄男/女（总计）51.08±11.898/5(13)

48.13±8.07*9/6(15)

*房颤组与对照组比较P>0.05两组一般情况比较

第58页/共70页对照组（n=13）

房颤组（n=15）

ODCa-ATPase/ODß-actin

6.63±3.69

3.58±2.16*

*与对照组相比P<0.05两组心房肌浆网Ca2+-ATPase

mRNA表达量的比较

第59页/共70页房颤组与对照组肌浆网Ca2+-ATP酶

mRNA表达量比较第60页/共70页心房(n=7)心耳(n=21)ODCa-ATPase/ODß-actin

3.36±3.49

5.54±3.12**两组相比P>0.05(