兽医流行病学 第十三章 分子流行病学

第十三章分子流行病学精选课件第一节分子流行病学的发展和定义定义：将分子生物学的理论和技术应用于流行病学调查研究，在分子水平上阐明疾病或医学事件在畜群或环境生物群体中频率分布及其决定因素的学科。精选课件分子流行病学的发展分子流行病学(molecularepidemiology)最早于1973年由美国Kilboume首先提出在80年代形成流行病学的一个分支学科。1、研究内容更加丰富传染病：传染源、传播途径、病原体检测鉴定疾病和健康状态相关生物标志的分布、影响因素、群体易感性、防治效果评价及病原生物的进化与变异规律等。精选课件2、研究手段越来越多初期：质粒图谱、核酸分子杂交、指纹图谱目前：核酸和蛋白质测序技术、酶技术、生物芯片技术等精选课件3、应用范围不断扩大预防医学、预防兽医学基础医学、生物学和环境科学精选课件分子流行病学产生的基础分子生物学理论：DNA双螺旋模型、遗传中心法则、遗传密码、RNA逆转录、基因表达调控等。精选课件遗传的分子基础双螺旋DNA分子模式BioTech核苷酸碱基脱氧核糖磷酸酯键精选课件表型的分子基础及蛋白质结构精选课件MutationCombination精选课件分子生物学技术：各种凝胶电泳、核酸体外扩增、DNA测序、蛋白质测序、分子杂交、基因克隆、色谱分析等，对核酸、蛋白质等生物大分子的检测鉴定水平大大提高。精选课件分子流行病学与常规流行病学不同点从分子(基因)水平上阐明疾病或其它医学事件的频率分布及其决定因素，常规流行病学从大体或表型上研究；仅研究疾病或医学事件的生物学方面，因此较常规流行病学的范围要小一些。精选课件第二节分子流行病学的研究内容传染性疾病心血管、肿瘤等慢性疾病遗传和代谢疾病的研究精选课件（一）传统流行病学研究遇到的难题1、病原生物的多样性和变异性

流感病毒、艾滋病病毒、口蹄疫病毒、传染性支气管炎病毒、马立克氏病毒等

从20世纪20年代至50年代，猩红热的病死率下降至原来水平的3.3%，近年无死亡病例。精选课件2、新传染病不断出现如SARS、尼帕病、O157大肠杆菌出血性肠炎等。精选课件过去30年来新发现的部分病毒性人兽共患病发现年代病毒引起的疾病宿主范围及危害发现地及流行范围1976Hanta肾出血综合症，汉坦病毒肺综合症人和啮齿动物（黑线姬鼠以及褐家鼠）朝鲜半岛发现，目前在世界广泛流行Ebola埃博拉出血热人类及非人灵长类动物（黑猩猩等），节肢动物和果蝠可能是贮存宿主非洲扎伊尔、印度尼西亚和菲律宾1981HIV艾滋病人类及非人灵长类动物美国发现，目前在世界广泛流行1979犬细小病毒犬细小病毒病人、家犬、犬科野生动物世界广泛流行1994Hendra马呼吸道症状，人出现脑炎人、马，果蝠是贮存宿主澳大利亚、巴布亚新几内亚1997Menangle猪出现繁殖障碍，人有类似感冒症状猪、人，果蝠可能是贮存宿主澳大利亚精选课件发现年代病毒引起的疾病宿主范围及危害发现地及流行范围1998Nipah猪出现呼吸道症状和神经症状，人出现脑炎症状库蚊、禽、畜、人马来西亚1999（1937）西尼罗河高烧、倦怠、有严重的头痛、眼痛、全身淋巴腺肿、脑炎、脊贿灰质炎样综合征人，野生动物（？）美国（乌干达）2003SARS非典型性肺炎冈比亚鼠、榛睡鼠、条纹松鼠、草原犬鼠、人中国猴痘发烧、咳嗽、皮疹、脓胞和淋巴腺肿蚊、人非洲、美国6个州2003（1993，1997）“圣路易斯脑炎”头晕、发烧、疲劳、肌肉酸痛、脑炎

美国精选课件3、耐药性病原体增多滥用抗生素和磺胺类药物使细菌的耐药性增强。如沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、结核杆菌、痢疾杆菌等。在1700多种感染性微生物中，近50%是动物源性的。精选课件4、慢性病的因果判断困难大多具有多病因、多阶段、多基因、长潜伏期等特征。需要对疾病自然史不同阶段的生物学事件进行深入研究。精选课件基因环境囊性纤维性变糖尿病爱滋病疾病-基因-环境精选课件5、个体的易感性差异暴露因素作用后，在不同时期体内发生的变化。致癌因子进入机体使正常细胞转化为癌细胞经历：启动、促进、转化和发展的过程。需研究个体在每一个过程中具有什么区别。精选课件传染性疾病病原体的分型和分类1、病原体通常以生物学或抗原特性分型或分类，2、以上特征往往是蛋白分子特异性导致，由于每一个个体的个体（种别）特性，它总是喜欢给自己一个特征以和其它个体（种别）相区别，这种特征与一些共同的特征相比，往往占据优势。3、但对于核酸分子，由于它的遗传特性和保守区域的存在在分类上占据一定优势，加上近年来分子生物学的飞速发展，应用越来越广。精选课件牛传染性鼻气管炎病毒各临床型分离的毒株具有相同抗原性根据限制性内切酶图谱分析，可分为I、Ⅱ、III型，Ⅱ型又可分为Ⅱa和Ⅱb两个亚型I型和Ⅱa亚型鼻气管炎

Ⅱb亚型外阴—阴道炎和龟头包皮炎

III型脑炎和流产精选课件传染源和传播途径分析口蹄疫：欧洲、美国都曾发生病毒从实验室外逸造成的爆发。精选课件用于病原体起源和进化研究犬细小病毒（CPV）—猫细小病毒（FPLV）和水貂肠炎病毒（MEV）重组而来CPV基因组左端约30％与MEV有较大同源性，而其余部分与FPLV有较大同源性。精选课件1984年Holmberg等报道，纽波特沙门氏菌（38Kb质粒耐药）—人群肠炎暴发流行牛饲料中添加了四环素，使耐药菌株在牛群中迅速成为优势菌株。用于细菌耐药性研究精选课件弯曲杆菌1997年10月，美国明尼苏达州卫生部报告从商店随机抽检肉鸡，污染率达79%，其中20%为耐药菌；火鸡污染率为58%，其中80%为耐药菌。精选课件耐药菌发展速度因不同细菌而异。金黄色葡萄球菌—大肠杆菌—沙门氏菌耐药性是否稳定，因不同细菌、抗生素而异。四环素、氯霉素、磺胺类耐药性相对稳定红霉素、庆大霉素相对不稳定葡萄球菌、痢疾杆菌产生耐药性后较稳定。精选课件肿瘤和心血管疾病肿瘤心血管疾病恶性肿瘤和心血管疾病是目前人类死亡的主要原因，也是动物死亡的重要原因之一。据WHO估计，全世界每年死于肿瘤的有540万人左右，而发生恶性肿瘤的新病例每年有740万人。中国目前有高血压病人6000万，每年脑卒中新病例130万，现患病例500万。目前，已找到了很多癌基因和高血压相关基因。精选课件遗传和代谢疾病各种遗传和代谢疾病都有一定的遗传基础，用分子流行病学方法对有害基因分布及遗传规律、高危人群进行研究，对有关疾病的病因学和防治研究具有重要意义。继乳光牙、短指症致病基因发现之后，我国在人类遗传病基因研究领域取得又一重大进展发现儿童白内障致病基因“热休克转录因子--4”精选课件对一种慢性舞蹈病Huntington氏病(HD)的分子流行病学研究就是一例。对不同家族染色体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析表明，HD基因与4号染色体的基因多态片段有关，从而在病因不明的情况下，通过分子流行病学研究，确立了疾病相关基因的定位精选课件MultiplexPCRanalysisforexondeletionsintheDMDgeneTwolaneswithresultstypicalfordeletions精选课件第三节分子流行病学的研究方法分子流行病学是将分子生物学的理论和方法应用于流行病学调查研究，其研究方法是分子生物学和流行病学方法的结合。精选课件分子生物学研究方法核酸电泳图谱分析（质粒图谱和RNA电泳图谱）核酸酶切图谱分析寡核苷酸指纹图谱分析基因探针和核酸杂交聚合酶链反应（PCR）核苷酸序列分析多位点酶电泳DNA芯片精选课件核酸电泳图谱分析（质粒图谱和RNA电泳图谱）精选课件精选课件精选课件精选课件核酸酶切图谱分析精选课件精选课件精选课件寡核苷酸指纹图谱分析精选课件基因探针和核酸杂交精选课件精选课件实例：NDV和H9亚型AIV的

分子流行病学精选课件新城疫部分

90年代以前全球范围内三次大流行，并被认为正在发生ND第四次大流行我国ND流行一直严重，以疫苗接种为主的预防工作成为生产常规后没有能很好地控制ND，并出现新的特点——免疫鸡群中非典型ND精选课件•九十年代后期，以匈牙利等国科学家组成的研究小组建立了一种在基因（F）水平上的NDV毒株分类方法，将ND发现以来的各国NDV株分为Ⅰ~Ⅷ8个基因型，并证明不同基因型分别在不同时期的流行中占主导地位：•第一次：基因Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型•第二次：出现新的基因Ⅴ型和Ⅵ型•第三次：属于Ⅵb亚型的鸽源NDV是起源•当前许多学者认为基因Ⅶ型NDV正在引起世界范围内第四次大流行精选课件目的了解我国鸡群中新城疫流行毒株的同源性与基因型常规疫苗对其保护力如何？为探索我国新城疫的防制策略打基础。精选课件•实验路线：不同时间和地区病毒分离（20个）↓↓

常规生物学特性研究选取特定基因的特定片段↓PCR↓测序动物保护实验分子流行病学研究↓↓制订防制对策↓执行↓评价和修改精选课件材料与方法•病毒来源：23个鸡源NDV中，标准毒株F48E8、Hert33及LaSota株由本实验室保存，20个分离株均由ND发病鸡群中按常规方法分离并通过与H5、H9亚型AIV的血凝交叉抑制反应确定不含AIV，分离背景见表1•病毒的毒力测定试验：按OIE方法进行

•致死鸡胚平均死亡时间（MDT）的测定•1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）的测定•引物设计：参照已发表的NDV毒株的F基因核苷酸序列设计两对引物，P1和P2用于扩增M基因1161nt至F基因889nt间长约970nt的片段，P3和P4用于扩增F基因862nt至F基因1700nt间长约839nt的片段。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，引物序列为：

•P15’-GCCGAATTCCCGAATCATCACGACGCTTAA-3’•P25’-GTGAAGCTTGAGTCTGTGAGTCGTAC-3’•P35’-CACCGGTACCCCTATTCTGATCG-3’•P45’-TTAAGCTTGTAGTGGCTCTCATCTGATC-3’

精选课件分离地点毒株分离年代福建FJ-1/851985福建FJ-2/991999江苏JS-1/971997江苏JS-2/981998江苏JS-3/002000江苏JS-4/012001江苏JS-5/012001江西JX-1/941994江西JX-2/991999山东ShD-1/012001山东ShD-2/012001山东ShD-3/012001上海SH-1/971997上海SH-2/981998新疆XJ-1/911991新疆XJ-2/971997新疆XJ-3/971997浙江ZhJ-1/851985浙江ZhJ-2/861986浙江ZhJ-3/971997

表1实验用20个鸡源NDV分离株精选课件•NDVF基因片段的扩增和克隆：扩增和克隆了20个分离株中的18株•病毒纯化•基因组RNA的抽提：参照吴艳涛等酚-SDS法•RT-PCR扩增F基因•克隆载体pGEMR-TEasy和转化感受态大肠杆菌DH5α

•重组质粒鉴定•挑取含阳性克隆的菌液，半固体穿刺培养•序列测定：阳性克隆交宝生物工程（大连）有限公司测定•序列分析：另从Genbank和已发表的文献中获取37个NDV参考毒株的相关序列，以DNAStar软件分析和比较F基因的核苷酸序列及其推导的F蛋白一级aa序列，参照匈牙利等国科学家方法，分析其基因型•根据F基因47nt至420nt之间的374nt片段序列绘制NDV遗传进化发生树•分析F基因334nt至1682nt之间的1349nt片段上HinfI、BstOI和RsaI三种RE位点分布精选课件•NDV遗传进化发生树的绘制：55株NDV分布于树形图上的9个主干分支，其中8个分支代表了国外已报道的Ⅰ~Ⅷ基因型（见图1）

•毒株FJ-1/85、ZJ-1/85、JS-1/97和F48E8在I型和III型之间形成了一个新的主干分支，彼此之间的同源性99.5~100%,与I型同源性为89.3~89.9%，与III型同源性为92.0~92.5%，差异显著，它们代表了NDV的一个新基因型，定名为基因Ⅸ型。•其余15株位于已知的Ⅵ和Ⅶ型分支精选课件

图1不同NDV遗传进化发生树

精选课件•基因Ⅵ型的分支较多，国外已将其分为a~e5个亚型。本试验中，有7个分离毒株归于基因Ⅵ型，其中XJ-1/91、JX-1/94和XJ-3/97在Ⅵ型分支中形成一个新的簇，组成了一个新的亚型，定名为基因VIf亚型；同样ZJ-2/86、ZJ-3/97、Sh-1/97和Sh-2/98组成另一新的亚型，定名为基因VIg亚型。在与相邻基因亚型的遗传距离上，Ⅵf与Ⅵb间为9.2~11.5%，Ⅵf与Ⅵg间为6.2~6.8%，Ⅵg与Ⅵd间为2.5~3.3%。精选课件•基因Ⅶ型毒株中已有Ⅶa~Ⅶd4个亚型的报道，本实验中归于Ⅶ型的8株NDV间同源性为93.1~99.7%，在遗传进化发生树的Ⅶ型主干分支中位于三个不同的亚分支，其中JS-4/01、JS-5/01、ShD-1/01、XJ-2/97和FJ-2/97归于Ⅶd亚型，JS-3/00归于Ⅶc亚型；JS-2/98和JX-2/99形成了一个新的亚分支，定名为Ⅶe亚型。从图1可以看出，该亚型毒株位于Ⅶb和Ⅶc亚型之间，与前者的遗传距离为3.0~5.0%，与后者的遗传距离为2.7~6.2%。精选课件•限制性内切酶（RE）位点的分布：NDV基因型的分类最初是以F基因334~1682nt间三种RE（HinfI、BstOI和RsaI）位点分布的差异为依据的，有些RE位点可作为鉴别基因型的标志。18个NDV分离株具有特征的RE位点分布（见表3）

表3I~IX基因型NDV毒株的F基因上RE位点分布精选课件73688311981350752953111614781601

54068387297315931625基因型和病毒GenotypeorStrainHinfIBstoIRsaIⅠ-+-++-+-++-+Ⅱ-----+----Ⅲ-++-+-++--Ⅳ+-+-+-+-+Ⅴ----+-+++----Ⅵa-+--+-+++-----+Ⅵb-+--+++------+Ⅵc-+--+-++-----+Ⅵd-+--+-+++-----+Ⅵe----+-+++-----+Ⅵf(XJ-1/91)----+-+-+--+-++Ⅵf(JX-1/94)-+--+-+++--+--+Ⅵf(XJ-3/97)-+--+-+++--+--+Ⅵg(ZJ-2/86)----+-++---+--+Ⅵg(ZJ-3/97)-+--+-+-+--+--+Ⅵg(SH-1/97)-+--+--++--+--+Ⅵg(SH-2/98)-+--+-+-+--+-++Ⅶa-+-+--+-----+-+Ⅶb++--+-+-+------Ⅶc(JS-3/00)-+--+-+-+--+---Ⅶd(JS-5/01)-+--+-+----++++Ⅶd(FJ-2/99)-+--+-+-++++---Ⅶd(ShD-/01)-+--+-+----++-+Ⅶd(XJ-2/97)-+--+-+-+--+---Ⅶd(JS-4/01)-+--+-+----++-+Ⅶe(JS-2/98)-+--+-+----++-+Ⅶe(JX-2/99)-+--+-+-+--+-++Ⅷ++--++----+---+Ⅸ(F48E8)-+--+-+-++++---Ⅸ(ZJ-1/85)-+--+-+-++++---Ⅸ(FJ-1/85)-+--+-+-++++---Ⅸ(JS-1/97)-+--+-+-++++---精选课件动物保护试验常规疫苗对各种不同基因型的分离株均有保护力各种不同基因型毒株之间的交叉保护力为100%精选课件结论我国存在不同基因型的NDV毒株不同基因型之间的主要保护性抗原没有发生改变（在我国的国情下考虑该问题）精选课件H9亚型禽流感部分H9亚型禽流感于1970年首次报道。20世纪90年代初，该亚型病毒在野鸟和家禽中的分离率还相对较低，没有造成大面积的流行。20世纪90年代后期以来，家禽（特别是鸡）的H9亚型AIV在亚洲和世界其它洲频繁报道。中国香港于1999年还报道从有明显类流感症状的病人体内分离到H9亚型病毒。中国大陆自1994年首次报道鸡群感染H9亚型病毒以来，该亚型病毒已在我国大部分省的鸡群中引起该病的流行，且在广东省也报道从有明显类流感症状的病人体内分离到H9亚型病毒精选课件几个研究表明，1999年从香港人体内分离到的H9亚型病毒来源于1997年从香港活鸟市场鹌鹑中分离的A/Quail/HongKong/G1/97（简称G1株）。最近日本、巴基斯坦和沙特阿拉伯等也报道分离到与G1株遗传关系很近的H9N2亚型病毒。Guo等对亚洲新形成的H9N2病毒亚系的研究表明，亚洲H9N2病毒可分为三个不同的亚系，其中一个亚系以香港G1株为代表，与香港人体内分离的H9亚型病毒有密切关系，并且对哺乳动物有致病性，氨基酸序列分析还表明这一亚系的毒株HA蛋白具有人受体结合特异性的氨基酸残基。精选课件李建伟等对山东1996年分离的一株H9N2亚型毒株的研究认为，该毒株是从北京1994年的一个分离株A/chicken/Beijing/1/94（H9N2）演化而来，且与香港人体内分离的H9N2毒株的亲缘关系较远。由此看来，H9N2亚型AIV的感染不仅给养禽业造成了很大的经济损失，还可能给人类的健康构成新的威胁。精选课件实施严格的生物安全措施和在流行地区使用疫苗是控制该病主要的方法。因此，弄清我国大陆H9N2亚型AIV流行株之间的关系以及该亚型病毒在疫苗免疫选择压力下的遗传变异情况对有效控制和消灭本病的流行具有重要意义。精选课件研究内容对从我国12个省1996年-2001年间分离到的25株H9N2亚型AIV流行株的HA基因全序列进行分析和比较，以阐明这些毒株之间的关系精选课件本研究的25株H9N2亚型AIV为我国大陆1996年-2001年期间的流行株，分别分离自我国：精选课件研究方法1.根据已发表的H9亚型AIV的HA基因序列，借助