罗永平-基因工程-讲义-2-3基因工程操作单元-转化-受体转法转率筛选6

DNA限制性内切酶DNA连接酶重组载体转入受体细胞筛选出阳性重组子（细胞）表达目的产物细菌质粒提取基因工程操作的基本步骤目的DNA载体（质粒）三.重组DNA技术的操作过程切接转增检第二章DNA重组克隆的操作单元表三.重组DNA技术的操作过程DNA的体外重组（切、接）用于基因转移的受体菌或细胞重组DNA分子的转化和扩增（转、增）转化子的筛选和鉴定（检）山西师范大学生命科学学院分子生物学课程组（一）DNA的体外重组（切与接）三.重组DNA技术的操作过程外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用。在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑三个因素：(1)实验步骤要尽可能地简单易行;(2)连接形成的“接点”序列，应能被一定的限制性核酸内切酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段;(3)对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。

1）相同粘性末端——同种内切酶生产的粘性末端的连接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG1.末端与连接无方向性2）相同粘性末端——同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BclIGCCTAGGATCCG5'

TACTAG5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT无方向性3）不同粘性末端的连接———切平或者补平BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC无方向性4）不同粘性末端加装人工粘性末端的连接

5’突出末端5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow补平Klenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamHIBamHIEcoRIBamHI无方向性CTGCA3'GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GC

GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG

CGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GC

GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG

CGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGPstISphI4）不同粘性末端加装人工粘性末端的连接

3’突出末端载体粘性末端同种碱基不能配对klenow补平单链缺口无方向性C3'GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT5）平齐末端加装人工粘性末端的连接无方向性6）粘性末端的更换BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseKlenow补平GATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'

5'EcoRIGGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker2.重组率1）重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。2）提高重组率的方法①提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1②载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'

p5'

GCTTAA

OH

5'5'

AATTCG5'

HO退火5'

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A

G5'G

A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶2.重组率2）提高重组率的方法③加装同聚尾末端：

CTGCA3'GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火C3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GC

GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG

CGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenow2.重组率（二）用于基因转移的受体菌或细胞受体细胞应具备的条件各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体外源基因克隆/表达系统目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（形成目的性状）。这样的一套体系。载体受体细胞原核生物基因表达系统真核生物基因表达系统根据受体细胞的不同，可以将基因表达系统分为

大肠杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统蓝藻表达系统等酵母表达系统植物细胞表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统等从安全性考虑：不适合在人体内生存不适合在非培养条件下生存在非培养条件下，其DNA容易解体它的DNA不易转移它的质粒（外源基因）只在这一宿主内复制便于检测1.受体细胞应具备的条件从遗传性考虑：外源基因不易被降解：如Redγ编码的蛋白Gam可以抑制大肠杆菌体内表达的RecBCD核酸外切酶活性，使体内的外源DNA不被降解。

遗传互补型：与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与载体选择标记互补的表型）转化亲和型：受体蛋白；具有较高的转化效率感染寄生缺陷型1.受体细胞应具备的条件从遗传性考虑：外源基因的存在形式对遗传性的要求若外源基因以质粒形式独立于基因组，还需：--重组缺陷型(recA－)--外切酶和内切酶活性缺陷(recB-，recC-)

--限制系统的缺陷型(hsdR-)，以利于非甲基化的外源基因高效转化1.受体细胞应具备的条件如E.coli常用克隆菌株DH5α、DH10B、JM109等和常用表达菌株BL21系列菌株等从遗传性考虑：外源基因的存在形式对遗传性的要求如果外源基因定点整合于基因组，还需：消除非同源重组【nonhomologous

endjoining(NHEJ)，自发重组】：如真菌中的Ku70和/或Ku80基因的敲除可消除非同源重组1.受体细胞应具备的条件如灰霉菌（Botrytiscinerea）、稻瘟菌（Magnaporthe

oryzae）灰霉菌（Botrytiscinerea），又称灰葡萄孢菌，是一种能够引起200多种已知植物（如水果、蔬菜及花卉）灰霉病的坏死营养型病原真菌。在空气中广泛分布，不仅能够侵染田间作物，同样会给植物的采后阶段造成巨大损失。日常生活中遇到的果蔬放一段时间会长毛，多数就可能是受到了灰霉菌的侵染。截止2013年，世界上尚未发现有任何一种植物对灰霉菌产生抗性。2013年10月4日，美国《科学》杂志上报告，灰霉菌除了会输送特殊蛋白质进入植物细胞内部，以抑制植物免疫防卫机制，从而达到有效侵染的效果外，还会利用一种叫做小分子RNA的分子进入植物细胞内部，从而抑制植物免疫系统，这也是首次发现有病原菌利用小分子RNA来达到有效侵染的效果。同时怀疑，除了灰霉菌外，其他侵染力比较强的真菌同样拥有这种利用小分子RNA的侵染机制。穿插内容2.各种基因工程受体的特性2.1大肠杆菌

遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定

适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌

产物结构复杂、种类繁多的内毒素2.2枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）

遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素

适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌

遗传欠稳定，载体受体系统欠完备2.各种基因工程受体的特性2.3链霉菌（Streptomyces)抗生素的主要生产者，主要用于抗生素生产菌株的改良分子遗传操作相对简便，不产内毒素遗传不稳定，生长相对缓慢主要使用PEG介导的原生质体转化2.各种基因工程受体的特性2.4酵母菌（yeast）

具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定

适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核受体菌

内源性蛋白产物种类繁多且含量高2.各种基因工程受体的特性2.5昆虫细胞（家蚕）

具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定

适用于真核生物基因的高效表达

DNA重组操作系统欠完善2.各种基因工程受体的特性2.6哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）

与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统

适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体

细胞培养条件苛刻，生长缓慢

2.各种基因工程受体的特性2.7植物细胞（拟南芥、烟草、水稻）

农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用

适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良

遗传操作繁琐

2.各种基因工程受体的特性3.实验室常用的基因工程受体大肠杆菌酵母菌哺乳动物细胞

CHO啤酒酵母、毕赤酵母DH5α、DH10B、JM109、BL21作业查阅文献，制作ppt，讲述以下某一种表达系统。枯草芽孢杆菌链霉菌黑曲霉里氏木霉蓝藻昆虫哺乳动物（三）重组DNA分子的转化和扩增（转与增）转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增根据前面所学和你自己的认识，谈谈：

如何才能将外源基因导入受体细胞？

需要做哪些处理？分组讨论5min后回答1.转化的原理与技术1.1细菌细胞的Ca2+诱导的热激转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等）1970年建立此技术原理：Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，液晶结构经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。

1.转化的原理与技术1.1细菌细胞的Ca2+诱导的热激转化大肠杆菌热激感受态细胞的制备：50ml菌体培养至OD600=0.4，冰浴15-30min，冷冻离心收集菌体用10ml冰冷的100mM

CaCl2溶液悬浮菌体，冷冻离心收集菌体,重复一次用2ml冰冷的100mM

CaCl2溶液悬浮菌体冰浴或加入10%甘油-80℃保存，备用1.转化的原理与技术1.1细菌细胞的Ca2+诱导的热激转化大肠杆菌感受态细胞的质粒热激转化：取100ml感受态细胞，加入含有大约50-300ng

重组载体的DNA连接液，混匀冰浴放置半小时在42℃保温30-90秒（热脉冲）快速将转化细胞转移至冰浴中放置2分钟加入1ml新鲜培养基，于37℃培养170rpm培养1小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选

1.转化的原理与技术1.2细菌原生质体的转化

革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子。

酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化

1.转化的原理与技术1.2细菌原生质体的转化不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。

细菌原生质体的制备：1.转化的原理与技术1.2细菌原生质体的转化取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10-20mlDNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀

细菌原生质体的转化：细菌原生质体的再生：

原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素

1.转化的原理与技术1.3l噬菌体DNA的转染感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5转染筛选：

加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，30℃培养1小时，稀释然后涂板筛选1.转化的原理与技术1.4电穿孔转化将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大1.转化的原理与技术1.4电穿孔转化大肠杆菌电激感受态细胞的制备：200ml菌体培养至OD600=0.5，冰浴15-30min，冷冻离心收集菌体用200ml冰冷的无菌水悬浮菌体，冷冻离心收集菌体，再用50ml冰冷的无菌水重复一次用50ml冰冷的10%甘油溶液悬浮菌体，冷冻离心收集菌体，重复一次冰浴或加入10%甘油-80℃保存，备用1.转化的原理与技术1.4电穿孔转化大肠杆菌感受态细胞的质粒电激转化：取45ml感受态细胞，加入含有35ng

以上重组载体的DNA连接液，混匀将感受态细胞和质粒DNA的均匀混合液加到电击杯底部将电击杯放进电转仪，在2500mV下转化5mS（电转）加入1ml新鲜培养基，于37℃培养150rpm培养1小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选

电穿孔法也可用于质粒消除实验含有抗生素抗性的质粒在没有压力筛选的情况下培养思考电激感受态细胞能否用于热激转化？热激感受态细胞能否用于电激转化？制作感受态的细胞在培养上有什么要注意的？动物细胞如何转化？2.转化率2.1转化率的定义转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，接纳DNA的受体细胞个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）2.转化率2.1转化率的定义例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子，也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞。另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA。2.转化率2.2转化率的用途利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，

经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个

重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？

若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：

104/107

/10-2/100%=0.1mg载体DNA

考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：

104/107

/10-2/20%=0.1/20%=0.5

mg载体DNA

载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选

2.转化率2.3转化率的影响因素1)载体及DNA重组分子方面：

载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同

载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低2.转化率2.3转化率的影响因素2)受体细胞方面：

受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高

2.转化率2.3转化率的影响因素3)转化方法方面：

受体细胞的预处理：影响最大受体细胞的菌龄细胞处理方法（感受态、原生质体、脱分化）受体细胞制作好后至转化操作时的时间间隔DNA与受体细胞的比例转化处理方法转化处理时间2.转化率2.3转化率的影响因素3)转化方法方面：

供受体的比例：Ca2+诱导转化0.1ml感受态细胞50ngDNA

不同转化方法的转化率：Ca2+诱导转化107-108/mgDNA

原生质体转化109个原生质体 50ngDNA

原生质体转化105-106/mgDNA

l-DNA转染107-108/mgDNA

电穿孔转化106-109/mgDNA(﹤100kb)3.转化细胞的扩增3.1扩增操作转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：

Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时原生质体转化后的再生过程

l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作

3.转化细胞的扩增3.2扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定（四）转化子的筛选和鉴定（检）载体遗传标记检测克隆DNA序列检测外源基因产物检测（四）转化子的筛选和鉴定（检）

由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子转化子重组子目的重组子1.载体遗传标记检测1.1抗药性筛选法抗药性筛选法的基本原理：

ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：

非重组子呈Apr、Tcr

重组子呈Apr、Tcr

将外源DNA片段插在BamHI位点：

非重组子呈Apr、Tcr

重组子呈Apr、Tcs

1.载体遗传标记检测1.1抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作：

先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子ApAp+Tc影印挑选1.载体遗传标记检测1.2营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法的基本原理：

营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。原理：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。

1.载体遗传标记检测1.2营养缺陷型筛选法常见的营养缺陷型筛选标记：

用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型1.载体遗传标记检测1.2营养缺陷型筛选法常见的营养缺陷型筛选标记：

TRdTMPdTDPdTTPTK胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（thymidine

Kinase,TK）在所有真核细胞中都有表达,是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶,它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP,继续磷酸化生成dTTP,参与DNA的生物合成。含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk

-）不能在含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补。

TK-细胞因氨基喋呤抑制了dTTP的合成而死亡，TK+细胞可存活，以此进行筛选。1.载体遗传标记检测1.2营养缺陷型筛选法常见的营养缺陷型筛选标记：dCDPdTDPdTTPAPAP氨基喋呤1.载体遗传标记检测1.3显色筛选法显色筛选法的基本原理：

显色筛选法可以区分转化子与非转化子（依靠抗生素等其它筛选标记），也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。1.载体遗传标记检测1.3显色筛选法显色筛选法的基本操作：

pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal重组子（Apr+lacZ-）

将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落

1.载体遗传标记检测1.4致死性筛选2.1PCR法2.克隆DNA序列检测2.克隆DNA序列检测2.2限制性酶切图谱法所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。2.克隆DNA序列检测2.2限制性酶切图谱法全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb区分重组子与非重组子用BamHI酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段重组子：2.7kb+4.0kb非重组子：2.7kb如果外源DNA片段也是2.7kb，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子2.克隆DNA序列检测2.2限制性酶切图谱法全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriSSBP4.0kb1.0kb0.8kb区分重组子与非重组子如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位点处，原则上也可用SphI酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每100单位50美元）。用HindIII和EcoRI联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及SphI的1/50

2.克隆DNA序列检测2.2限制性酶切图谱法全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb区分目的重组子与非目的重组子用EcoRI酶切转化子质粒DNA目的重组子：3.0kb+3.7kb或者：1.0kb+5.7kb用PstI酶切转化子质粒DNA目的重组子：3.2kb+3.5kb或者：0.8kb+5.9kb2.克隆DNA序列检测2.2限制性酶切图谱法全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBE4.0kb2.0kb2.0kb区分目的重组子与非目的重组子对图示的克隆片段，转化子质粒DNA用EcoRI酶切开后，只出现2.0kb和2.7kb两条带子，实际上2.0kb的条带中含有两种不同的分子2.7kb2.0kbE2.克隆DNA序列检测2.2限制性酶切图谱法部分酶解图谱法：2.2kbPstIEcoRIBamHIBBE4.4kb1.21.8kbEB0.60.8该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：BamHI全酶解：0.60.8

5.2

kbBamHI+EcoRI全酶解：0.60.81.81.2

2.2

kb其中，1.2kb片段的存在表明该片段位于一端BamHI部分酶解：1.42.6

4.0

kb其中，1.4kb的片段必为0.6kb和0.8kb两片段，表明两者是连在一起的；同理，2.6kb的片段必为0.8kb和1.8kb两片段，表明两者是连在一起的；最后，4.0kb的片段必为0.6kb和3.4kb两片段，表明两者是连在一起的2.克隆DNA序列检测2.3菌落噬菌斑原位杂交法菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据

控制杂交和洗膜的缓冲液2.克隆DNA序列检测2.3菌落噬菌斑原位杂交法菌落原位杂交法的基本操作：影印用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板

洗涤杂交感光用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜

用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜

80℃烘干固定影印薄膜

薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜

用X光胶片覆盖薄膜感光

2.克隆DNA序列检测2.3菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结构（双链DNA可用碱变性）

足够长度（至少12个碱基）内部不含互补区

探针的制备方法或来源包括：人工合成cDNA合成

同源序列mRNA

2.克隆DNA序列检测2.3菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：T4-PNP介导的末端标记5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5‘p3‘HOOH3‘p5‘T4-多核苷酸磷酸激酶2.克隆DNA序列检测2.3菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：逆转录酶介导的反转录标记3’AAAAAAAAAAACCAGCUUCC···GAACUGAUUUAGGCU5’mRNA反转录酶Mg2+dNTP+pppdATP（a-32P-dATP）5’TTTTTTTTTTT5’mRNA3’cDNA3’AAAAAAAAAAACCAGCUUCC···GAACUGAUUUAGGCU5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGG···CTTGACTAAATCCGA2.克隆DNA序列检测2.3菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：DNA聚合酶介导的缺刻前移标记5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Mg2+5‘dNTP

5‘ppp

dA（a-32P-dATP）5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-GA-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘

5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘

DNaseIDNApolI2.克隆DNA序列检测2.3菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：ABC荧光标记GCTTGAGCAGTAACCTG荧光胺Biotin生物素Avidin生物素结合蛋白烷烃连接臂2.克隆DNA序列检测2.3菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：ABC显色酶标记GCTTGAGCAGTAACCTG显色酶Biotin生物素Avidin

生物素结合蛋白烷烃连接臂生色底物颜色产物2.克隆DNA序列检测2.3菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：地高辛系统标记dUTP-连接臂-甾醇半抗原digoxigeninDIG抗体-显色酶交联复合物2.克隆DNA序列检测2.4DNA序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本原理：

DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列其关键技术有：DNA链聚合反应时的定点随机中断（ddNTP）聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600bp/601bp）电脑自动检测、记录、编辑程序用于DNA测序的专一性试剂盒（Kit）

在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。2.克隆DNA序列检测3.DNA序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本操作：

A

C

G

T

ssDNA

ssDNA

ssDNA

ssDNA

Primer

Primer

Primer

Primer

KlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsddATPddCTPddGTPddTTPA

G

T

C

DNA聚合反应聚丙烯酰胺凝胶电泳2.克隆DNA序列检测2.4DNA序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本反应：

KlenowOH3'5'PTdNTP+ddATP

TTTTTOH3'5'PA

G

T

C

GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA3.外源基因