植物原生质体培养

第六章：植物原生质体培养请问同学们你知道哪些植物育种的方法？（杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种、基因工程育种、植物组织培养、植物体细胞杂交、动物细胞核移植等。）自1999年11月20日中国的神舟飞船首飞获得成功后，2012年6月16日18时许中国的载人航天飞船“神舟九号”发射成功，6月29日10时许，神九载人飞船返回舱在内蒙古主着陆场安全着陆，这次发射验证了空间交会对接技术，首次实现地面向在轨飞行器进行人员和物资的往返运输与补给，我国的载人航天工程的“空间实验室”工程有望实现。2002年12月30日凌晨“神舟”四号发射升天，一起带入太空的还有一批特殊的乘客——100粒牡丹花种子。有着“牡丹城”之称的洛阳，将牡丹种子送上太空进行育种，是洛阳城“牡丹战略”的一个重要组成部分。经过太空环境的各种重粒子、强辐射等作用，相当一部分种子的性状会发生较大的变异，也许牡丹花开的会更大更鲜艳。“神舟四号”共搭载了几百种的此外，太空环境还是一个微重力环境。中科院（上海生命科学研究院植物生理生态研究所和中科院上海生物化学细胞生物学研究所）的科研人员，分别将精心培育了10年的不同品系的烟草细胞，小白鼠淋巴细胞和骨髓瘤细胞也带入太空，进行了太空细胞电融合实验（由于重力沉降现象消失，不同的细胞更容易融合，提高融合率和细胞存活力），以期获得新品种。这就是这则新闻提到的动植物细胞举行的“太空婚礼”。自然条件下，植物间遗传物质的交换可以通过有性生殖来实现，保持物种稳定性的同时，也推动了物种的进化。但物种间存在的生殖隔离，制约了物种间的遗传信息的交换和整合，也限制了通过杂交进行的作物遗传改良。因此，人们就想方设法，从其它的途径寻找突破口。细胞融合技术为克服这一障碍提供了一条新的途径。而植物细胞是有细胞壁包裹的，实现细胞融合，首先要突破细胞壁的障碍。6.1原生质体的概念和研究进展6.1.1原生质体的概念原生质体(protoplast)：我们把除去细胞壁、裸露的、有生活力的原生质团或是说一个被质膜所包围的裸露细胞，称为原生质体。它是能存活的植物细胞的最小单位。与原生质体相关的一些概念，如（课本P128）：亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质（少量细胞质）包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。核质体和胞质体一个是缺少了细胞核，一个是缺少了部分的细胞质。如果用脱核技术，细胞经松胞菌素B(CytochalasinB；CB)处理、并离心（以10mg/L的浓度浸没,以12000r/min离心15～20分钟），细胞核可从细胞中分离出来，可使99%的细胞发生脱核，形成无核细胞质体(Cytoplast)和无胞质的核质体(Nucleoplast)，可用于做多种研究。6.1.2原生质体研究进展1）认识阶段：自从迪雅尔丹(F.Dujardin,1835)在低等动物根足虫和多孔虫（原生动物）的细胞内.发现了内含物（十分均匀、有弹性、能收缩的胶状物质），称之为“肉样质”(sarcode)。其后1840年普金耶（Pukinje）在动物，1846年冯·莫尔(VonMohl)在植物细胞中也看到了“肉样质”的东西，并命名为“原生质”。1861年舒尔策（MaxSchultze）认为动物细胞内的“肉样质”和植物细胞内的“原生质”具有同样的意义。由此提出了原生质理论：有机体的组织单位是一小团原生质，这种物质在一般有机体中是相似的。至此，细胞的含义就和最初发现时大不相同了。于是汉森（Hanstein，1880）就提出“原生质体（protoplast），准确的说动物细胞就是一个原生质体。但由于cell（原意“小室”）一词沿用已久，因此人们仍采用了旧名。2）原生质体分离研究阶段（机械法）：1892年Klercker（克莱克）首先用机械法分离得到原生质体，将叶肉细胞、愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中，使之质壁分离，原生质体收缩成球形。这时用剪刀剪碎组织，就有可能切开细胞壁后获得少量完整的原生质体。但数量少且易受损伤。3）原生质体分离研究阶段（酶法）：1960年，英国植物生理学家Cocking（科金）首先用酶解法从蕃茄幼苗的根分离原生质体成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。直至1960年后纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。4）原生质体再生植株研究阶段：1971年，Takebe（日，塔克伯）etal.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。6.1.3原生质体研究的意义1)单细胞无性系的建立经过原生质体培养，可产生单细胞无性系（cellcloning），以及再生植株(regenerativeability)。而单细胞无性系为在细胞水平上进行的突变体的筛选、次生代谢物生产、人工种子生产、种质资源库的建立等提供了非常理想的受体系统。植株再生的研究的一个方面是细胞分化，在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同物理、营养和激素条件，来探索诱导单细胞的分化条件等。2）遗传转化的良好受体原生质体无细胞壁，易于摄取外源遗传物质、细胞器等，在遗传学方面进行基因互补，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究等，为植物基因工程研究提供了理想的遗传实验操作体系。3）体细胞杂种的形成用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法。由于细胞壁被溶解，有利于细胞间相互融合，克服了常规育种中远缘杂交的生殖隔离障碍，有利于培育新的品种。4)多种基础研究的实验体系利用原生质体可以进行许多基础理论研究，如研究细胞生理（因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以便反应产物能较快的分离出来），细胞的分化和发育，研究细胞质膜的结构和功能，细胞壁再生的、病毒侵染机理等方面的研究。此外，从原生质体中可提取细胞器或DNA，用于进一步的研究。6.2原生质体的制备要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁，在本世纪前期是采用机械法分离。这种方法分离的原生质体太少，且只能适于部分组织，Cocking（1960年）发明的酶解法，开创了大量分离原生质体的新技术，现在被普遍应用。我们以酶处理方法为例，介绍原生质体的分离。6.2.1一般来说根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但要选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。植物的其它器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。常选用的材料是悬浮培养细胞和叶肉细胞：1)细胞悬浮培养物在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。即取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件（有利于细胞脱分化）下，在含2，4－D（诱导愈伤组织或体细胞胚作用显著）2～4mg/L的MS固体培养基上（应用最为广泛），诱导愈伤组织，每隔2～4d转接一次（愈伤组织的继代培养，一代为20d。如果延长培养时间，培养基中的营养物质会减少，外植体也会分泌一些有毒物质，造成自身中毒。）从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80～120r/min，在25±1℃悬浮培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取4～5ml悬浮细胞转到250ml三角瓶的40rnl新鲜培养中，以后每隔7d继代一次（每个7d一次的继代周期中，拟南芥悬浮细胞的生长表现明显的S型生长曲线，正常培养条件下,继代后2～4d出现快速生长,此后生长量迅速下降,但接种量不同,其继代后悬浮细胞生物量及快速增长发生时期不同.维持7d继代周期的理想接种量为起始悬浮液按10mL/50mL稀释.接种量小,生长迟缓,甚至不能增殖）。通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。2)叶肉细胞叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，要考虑植株的生长环境，用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力（考虑环境的光线、温度、湿度等①光强为3000～6000Lx；②温度为20～25℃培养；③相对湿度在60～80％左右）利用无菌苗可免去表面灭菌的操作步骤避免因条件不适而产生的材料生长的不良影响。6.2.2机械法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。缺点：获得完整的原生质体的数量较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。优点：可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。酶法：将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。该过程可分为两个阶段：酶处理、原生质体的收集和纯化。优点：获得量大，适用广泛。缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，会影响所获原生质体的活力。酶处理（A-C）分离原生质体最常用的酶有纤维素酶（从绿色木霉等提取的一种复合酶制剂，具有降解纤维素作用）和果胶酶（从根霉中提取出来，使细胞间的果胶质降解）。A.取生长3周的烟草无菌苗平展嫩叶，置于含有一薄层600mmol/L甘露醇-CPW溶液中（渗透压稳定剂，提高原生质体的分裂频率，适应培养基的高渗环境等作用），在4℃黑暗（低温和黑暗条件下，减少代谢活动）下预处理6-8小时；悬浮细胞置于4℃黑暗下预处理48小时（光照有利于细胞分化）。

B.预处理的叶片用吸管吸去预处理液，转入培养皿中，然后加入2％纤维素酶、0.4％果胶酶溶液（植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液10~30ml不等。），用封口膜将培养皿封严，置于暗处在24～26C.在倒置显微镜下观察，细胞壁已降解，有圆球形原生质体释放到溶液中，即终止酶解（一般酶解12～24h）。用吸管轻轻压挤，以释放出全部原生质体；酶解时间、温度和酶的浓度影响着原生质体的活力。6.2.3在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。以净化原生质体，清除这些杂质的过程称为原生质体纯化。（植物单细胞分离后过滤，经洗液悬浮，再离心收集；原生质体收集也要先过滤，然后离心，但其要求的纯度更高，离心时在溶液中加入渗透压稳定剂）。目前原生质体纯化方法有三种，即沉降法、漂浮法和不连续梯度法。沉降法：是在比重小、具有一定渗透压的溶液中，先对酶液处理好的混合物进行过滤，然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉降于试管底部的纯化方法。常用甘露醇（小分子量）作渗透压调节剂，再用Percoll漂浮一次。对离心力无严格要求，操作比较简单，但在游离和清洗过程中易损伤原生质体（原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压）。漂浮法：是采用比原生质体密度大的高渗溶液，使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。常用的漂浮剂有蔗糖、Percoll（珀可，一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，其混悬液的硅胶颗粒大小不一,经过高速离心后,可形成一个连续密度梯度,将比重不同的细胞分离纯化）、Ficoll（聚蔗糖）、fructosan（聚果糖）。避免原生质体振荡或被离心力挤压而损坏，所用药品简单，成本低；但对离心力要求严格，掌握不好，原生质体不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。不连续梯度法：采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。如：Hughes(1978)采用450mmol/L蔗糖（底部）和450mmol/L甘露醇（顶部）不连续梯度来纯化原生质体。想一想：离心的结果，原生质体层在溶液的什么位置？（蔗糖层在下层，甘露醇在上层，原生质体在蔗糖层和甘露醇层之间）。可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体相互挤压而破碎。6.2.4在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。测定原生质体活性有多种方法，如观察胞质环流、活性染料染色、用荧光素双醋酸酯（FDA）染色等。目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。形态上完整、富含细胞质、颜色鲜艳的正常球形原生质体为有活性的原生质体。如果将其由低渗溶液中转入高渗溶液中，细胞会膨大恢复原状。FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。而无活力的原生质体不能分解FDA，因此无荧光产生。伊凡蓝染色法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。此外，还有酚藏红花染色法（无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色）等。6.2.51）供试材料：生长旺盛、生命力强的组织。如：幼嫩叶片，无菌苗子叶和下胚轴，愈伤组织或细胞悬浮物，花粉细胞（单倍体特殊材料）。2）酶解条件不同植物种类、组织和细胞由于细胞壁结构、组成不同，分解细胞壁所需酶的种类、浓度、组合及酶解时间也不同。酶制剂活力和纯度：粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活力是有害的。因此，在使用之前须将这些酶纯化，一般利用凝胶柱使酶制剂脱盐纯化。不同的厂家生产的酶的活性有差异。如：上海植物生理研究所从野生型绿色木霉中提取制成的ZA3—867纤维酶不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。（德国sigma纤维素酶的价格）酶解温度（酶的最适温度为40～50℃，实际分离温度一般为25～30℃）、酶解时间（一般而言，分离原生质体的培养时间与温度成反比，可是高温下短时间分离的原生质体不适于培养，他们易发褐和破裂。实际酶处理时间一般不超过24小时。）、酶溶液的pH（酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5．0时，酶活力高，原生质体产生一得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。当pH值提高到6．0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5．0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始pH值提高到7．0时酶活力差，生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多）。3)渗透稳定剂的作用在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其活力的作用。由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。在原生质体研究中，常用的两种渗透压稳定系统为：a、糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40～0.80mol/l。可使分离的原生质体能再生细胞壁，并能继续分裂。其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。（

多数情况下，甘露醇是常用的渗透剂，可能是由于它的钝性及扩散入原生质体的速度很慢的缘故，这样一来能保证一个稳定的渗透压。）b、盐溶液系统：包括KCl、MgSO4和KH2PO4等。其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培；不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。（简单说，盐溶液系统使获得的原生质体更稳定，也更容易培养）。近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳剂的培养基中培养。此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾（质膜稳定剂，硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂，另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG）），它可提高原生质体的稳定性，降低酶液中核酸酶的活力，并使离子稳定，保护原生质膜，使细胞持续分裂，对形成细胞团有促进作用。另外，添加牛血清蛋白(Bovineserumalbumin,BSA)可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏（血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。在ELISA等试验中，常用作封闭剂，作为中性蛋白填充空置位置，防止非特异性背景标记。还有氯化钙等）4）光照由于脱壁的原生质体对光非常敏感（植物细胞大多含有光敏色素，吸收红光，调节细胞的生长发育，导致原生质体膨大，易破裂），分离原生质体的过程一般是在黑暗条件下进行的。此外，分离的条件，如离心次数、离心速度、分离持续的时间、分离用具等也会影响原生质体的活力。所以操作中一定要注意这些问题。6.3原生质体培养原生质体培养的概念：指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。原生质体培养只是原生质体研究的一个方面——再生植株。6.3.1培养原生质体的方法1）液体浅层培养液体培养法是在培养基中不加凝胶剂，原生质体悬浮在液体培养基中静止培养的方法，常用的是液体浅层培养法，即含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。优点：原生质体在液体环境中表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。2）双层培养又分为液体-固体双层培养和固体-固体双层培养法。在培养皿的底部铺一层琼脂（琼脂糖），再将原生质体悬浮液或等体积的琼脂与原生质体悬浮液混合液涂布在固体培养基表面。优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体或上层培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。3）固体薄层培养该法是将悬浮在液体中的原生质体悬液与热融的含琼脂的培养基等量混合，冷却后原生质体包埋在琼脂培养基中，封口后进行培养。其不同之处在于，原生质体接种的细胞多，植物细胞培养接种的细胞少。优点：使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必须合适，温度偏高影响原生质体活力，温度偏低琼脂凝固太快，不利于原生质体混合均匀。另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。由于琼脂熔点较高，因此在固定培养中保持琼脂培养基较高的温度和相对剧烈的摇动是使原生质体在培养基中分布均匀的前提，这样就容易对原生质体造成伤害。此外，琼脂对原生质体是有毒害的，只能是一些生命力较强的植物原生质体才可以用这种办法来培养。为此，人们不断寻求低毒并可在常温下凝固的物质来代替琼脂。近年来很多实验证明，琼脂糖是一个良好的培养基凝胶剂，它不仅具有熔点低的特点而且具有促进原生质体再生细胞分裂的作用。对琼脂糖、琼脂及经过漂洗的纯净的琼脂的比较试验，发现尽管纯净的琼脂可以提高一些原生质体的植板率，但最好的结果是在琼脂糖上取得的，并且琼脂糖适用于广泛的植物种。他们发现在琼脂中不能分裂的天仙子属的一种在琼脂糖中能持续分裂并且比在液体培养基中形成细胞团的频率高。在琼脂糖培养基中，烟草原生质体发育到细胞团所需的接种密度要比在琼脂或液体培养基中的低。在水稻原生质体培养也证实，提高琼脂糖的浓度可以明显地提高原生质体的引起的出芽现象，从而提高了培养初期的原生质体的成活率。由于上述原因，琼脂糖作为一种优良的凝胶剂，在原生质体培养中的应用越来越广泛。4）琼脂糖珠培养类似于植物细胞培养，我们还可以进行琼脂糖珠培养。将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50μl一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。其它用于细胞培养的一些技术，如悬滴培养、微室培养、看护培养等技术，也已在原生质体培养中得到应用。6.3.2原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分化出完整植株的过程。1）细胞壁再生按照前面介绍的方法培养原生质体。原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。新合成的细胞壁可以用0.1％荧光增白剂（Calcofluor-white,CFW）染色后在荧光显微镜下观察，可见到绿色荧光围绕细胞表面，证明细胞壁已经形成（CFW专一性地与细胞壁纤维素的β-葡萄糖苷键特异性地结合）。也可用高渗溶液产生质壁分离的方法、电子显微镜观察技术和冰冻蚀刻法等进行再生细胞壁的研究。电镜分辨率较高，可观察到纳米级的结构（透射电镜（分辨率达0.2纳米）--细胞内部结构；扫描电镜（分辨率5~7纳米）--组织、细胞和器官表面和立体结构；最小的细胞是支原体，直径100nm）。电镜观察发现，原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成分的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，以后在质膜与片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。再生细胞壁主要成分为非纤维素多糖，其葡萄糖占65%，纤维素只占5%（烟草叶肉细胞细胞壁纤维素含量占60%）。细胞壁的形成与细胞分裂有直接关系，凡是不能再生细胞壁的原生质体也就不能进行正常的有丝分裂。细胞壁的再生标志着原生质体培养成功。2）细胞分裂和生长一般原生质体培养2～7d后开始第一次分裂，但开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。用幼苗的下胚轴和子叶、幼根、悬浮培养的细胞、未成熟种子的子叶等为材料分离的原生质体，一般比用叶肉分离的原生质体容易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快。(Figure1)AsymmetriccelldivisionofaPhyscomitrellaprotoplast.Regularasymmetriccelldivision(1,2)anddefectivecelldivisionwithoverexpression(3,4).Cellwallofthecellin(1)isvisualizedwithcalcoflorin(2).细胞分裂时，在两组染色体之间，也就是在母细胞的赤道板面上，有许多大小不一的分泌囊泡(secretoryvesicles)不规则地汇聚在一块，这些小囊泡是由高尔基体和内质网分泌而形成的，其中富含组成细胞壁的各种糖类，它们借助与细胞赤道板垂直方向上存在的微管的运动，逐渐整齐地排列成片，组成成膜体(phragmoplast)。成膜体中的囊泡膜相互融合与连接形成细胞的质膜，其中的内含物连成一体构成细胞板，这是雏形的中层结构。细胞板组成后，高尔基体小泡运输造壁物质释放到质膜外，以充实新形成的壁。当细胞板中逐渐有果胶质和少量纤维素分子不断地填充和掺入时便构成了中胶层，在中层两侧陆续有纤维素和半纤维素等物质的沉积则形成了质地柔软的初生壁，这时两个子细胞便形成。此后高尔基体小泡将构成细胞壁的糖蛋白的前体物质运输和分泌到细胞壁中，与纤维素、半纤维素及果胶相交联，形成高度复合体的网状结构。同时，其它蛋白和各种酶通过高尔基小泡和内质网小泡运输和分泌加入细胞壁，形成完整的初生细胞壁。3）愈伤组织形成大多数情况下原生质体培养二周后，形成多细胞的细胞团，三周后形成肉眼可见的小细胞克隆。大约六周后形成直径1mm的小愈伤组织。原生质体培养7～10天后必需及时添加新鲜培养基，否则形成的细胞团不继续生长。待小愈伤组织长至1mm左右时应及时转移到固定培养基上使其进一步生长。4）植株再生原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可一步成苗。然而，越来越多的试验证明，两步法成苗更适合大多数植物原生质体再生植株。即：首先将愈伤组织培养于含低浓度生长素培养基上，让其增殖和调整状态，再将其转移到分化培养基上分化成苗。回顾原生质体的再生过程：原生质体在合适的培养基和适宜的培养条件下，经2～4d可再生细胞壁，并很快进入细胞分裂状态，约约1～2个月后，通过细胞的持续分裂，在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到2～4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导芽和根长成完整的植株。6.3.31）基因型较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所控制的。通过番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗传分析，证明其愈伤组织的再生能力是2个显性基因所决定的(KoornneefMetal.,1987)。Cheng和Veilleux(1991)对马铃薯野生二倍体种(S.Phureja)原生质体的培养能力也做过遗传分析，并证明从原生质体培养到形成愈伤组织是受2个独立位点的显性基因所控制(Chengetal.,1991)。Dudits等（1991）用苜宿(Medicagosativa)不同基因型做了较深入的研究，认为有某个基因型在离体培养时难以形成细胞胚。但是，如果将对激素调节有作用的发根农杆菌的rolB和rolC基因引入并表达，就可能促使其体细胞胚形成。2）原生质体的来源供体材料体类型：叶肉细胞、愈伤组织或悬浮细胞生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物（Suspensioncultures）、原球茎、花瓣和叶表皮等。叶肉细胞是常用的材料,因为叶片很易获得而且能充分供应。取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片。另一个分离原生质体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞，采用其作材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒.

供体细胞的分化程度：同原生质体分离相同，原生质体的活力和再生能力与外植体的来源，或者说供试材料的生理状态密切相关。子叶及下胚轴获得的原生质体培养对培育壮苗至关重要。供体细胞的生长同步性：悬浮细胞在生长过程中，也不是所有的细胞都适合原生质体的培养。尤其是多次继代的细胞容易出现染色体结构和数量变异。我们可以通过过滤，筛选形态大小较一致的悬浮细胞，除去老细胞，便于对原生质体培养的控制。3）起始培养密度基本起始密度：原生质体培养基中原生质体的密度对分裂的影响很大，培养的适宜密度在104～105个/ml左右。在烟草叶原生质体培养中，密度低于103个/ml时，细胞只能分裂一、二次，且能持续进行下去，密度在104个/ml以上，植板率常显著提高。低密度条件原生质体不能生长的原因，可能在于细胞代谢产物扩散到培养基中去，而影响细胞内的浓度。如在培养基中添加若干代谢中间产物，低密度的原生质体生长发育也能正常进行。4）培养基和细胞培养相比，原生质体只是缺少了细胞壁，因此原生质体培养基一般是加以改变的细胞培养基。（如原生质体培养经常使用的KM-P培养基就是以B5培养基为基础；NT培养基则以MS培养基为基础。）但原生质体无论在结构上和代谢生理上和细胞毕竟是有很大差异，在培养原生质体时，单纯地模仿细胞培养基往往不能达到满意的培养效果，需要考虑到原生质体的独特要求。a、培养基激素水平：激素对原生质体的生长发育是非常重要的。但由于不同的植物种对激素的种类和浓度有很不同的要求，对牛豆树原生质体培养认为2,4-D对细胞分裂是必不可少的，并且不能用NAA和IAA来代替，这种在细胞内合成的激素和其他细胞内物质向外释放时，外渗的速度和能力也不相同。内源激素外渗后，提高了培养基中激素的浓度使得不同植物原生质体对外源激素的种类和浓度的需求产生了很大差异。由于细胞在培养过程中能够合成一些物质并外渗到培养基中，利用这个特点来制成“条件培养基”，即对某种材料的细胞培养一定时间后，培养基中已含有这种材料外渗的激素、氨基酸等物质，再把这种材料的细胞去掉。用这种条件培养基足以促进其他材料的细胞生长。用培养了3天的长春花细胞的悬浮培养液作“条件培养基”，加到长春花原生质体培养基中，极大地促进了长春花原生质体的生长和分裂。用条件培养基作烟草原生质体低密度培养也提高了培养效果。尽管原生质体培养对激素的种类和浓度的要求有很大差异，但总的来说，生长素和细胞分裂素是需要的，并需要二者的适当搭配。同时，在不同的发育阶段需要不断地对激素的种类和浓度进行及时的调整。此外，在每一步调整激素时，还须考虑到它的后效应。如牛豆树原生质体培养中，再生细胞的起始分裂需要有2,4-D存在，但它对以后的器官分化却有抑制作用。而实际上，器官分化的决定因素在愈伤组织形成的初期就发生了，如果只为了愈伤组织的发育而继续保留较高浓度的2,4-D，就有可能抑制器官发生而使原生质体培养不能获得再生植株。b、无机盐无机盐以离子状态存在于培养基中，易于被植物细胞吸收和利用，无机盐是培养基的主要构成成分，根据其含量，可分为大量元素和微量元素两部分。在大量元素中，对原生质体培养效果影响最大的是Ca2+和NH4+。较高的Ca2+浓度能提高原生质体的稳定性，这是由于Ca2+能保持原生质体质膜的电荷平衡。因此很多游离原生质体的酶液中都添加一定量的Ca2+和其他阳离子。在培养中，较高浓度的Ca2+对原生质体的生长发育同样有利。如高浓度的钙促进了豌豆原生质体的存活和细胞分裂。因此，在很多植物的原生体培养中，应用大量元素减半的MS培养基时，但Ca2+的浓度未降低，保持MS培养基中所用的浓度。虽然氮源是植物细胞不可缺少的营养，但已发现高浓度的NH4+可抑制马铃薯原生质体的生长发育。在有关菊苣叶肉原生质体培养时，把MS培养基中的氨和硝酸盐全部去掉，只用谷氨酰胺作为氮源，得到了好的结果。把水稻原生质在B5培养基上培养8~10天后，转移到完全去除无机氮素，而用4种氨基酸作为氮源的AA培养基上，获得了来源于原生质体的水稻再生植株。无机营养中铁、钙、铵等的浓度对原生质体培养有重要影响。铁盐大多采用MS培养基中的