人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定

人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定摘要】目的:探讨和建立适用于人心肌成纤维细胞体外培养及鉴定的技术方法。方法：从将进行心脏手术患者体内取右心耳组织，用胰蛋白酶消化法消化分离细胞，再通过差速贴壁分离法收集心肌成纤维细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养并传代，光学显微镜下观察心肌成纤维细胞基本形态特征的变化，波形蛋白（Vimentin），a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA），㈣因子（VWF）抗体对细胞进行免疫荧光鉴定。结果：形态学观察和免疫荧光鉴定显示，成功培养心肌成纤维细胞，纯度达95%以上。结论：胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法及免疫荧光鉴定是一种简单有效的人心肌成纤维细胞培养方法。建立了一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养模型。【关键词】心肌成纤维细胞原代培养胰蛋白酶消化法差速贴壁分离法免疫荧光【中图分类号】R39【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）30-0052-03心肌纤维化是各种心血管疾病发生、发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一，而心肌成纤维细胞在这一过程中发挥着极其重要的作用。当前，心肌成纤维细胞体外实验研究模型主要集中建立在动物的心肌，人的心肌成纤维细胞体外实验研究模型鲜有文献报道。我们参照Neuss等学者差速贴壁分离和培养人心脏成纤维细胞的方法［1］，采用胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法，成功分离培养出人心肌成纤维细胞，摸索出一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养方法，为人心肌纤维化研究及人心肌成纤维细胞增殖模型的建立提供了一种方法，现作报道。一、材料与方法（一）、材料：取福建省立医院建立体外循环将进行心脏手术患者心脏停跳前的右心耳组织约30mg，放入置于冰面上盛有PBS的无菌培养皿并立即送入实验室进行下一步细胞分离培养。（二）、主要试剂及配制胰蛋白酶（美国Amersco公司），DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone），免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠cy3（碧云天生物技术研究所），免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC（碧云天生物技术研究所），V2258小鼠波形蛋白单克隆抗体（美国Sigma公司），A2547小鼠a-SMA单克隆抗体（美国Sigma公司），F3520兔VWF抗体（美国Sigma公司）。酶消化液:将胰蛋白酶溶于PBS缓冲液（pH7.2〜7.4）中，配成0.25%胰蛋白酶消化液，现配现用。基础培养液：1包装DMEM干粉倒入约400ml膜去离子水中，磁力搅拌溶解，加膜去离子水至900ml，加NaHCO33.7g，青霉素和链霉素各10万U使终浓度为100U/ml，调PH值至7.2〜7.4，加膜去离子水定容至1000ml，0.22um滤膜过滤除菌后分装，4°C保存。2周内使用。临用前，加入20%胎牛血清。（三）、主要仪器AL104电子天平（瑞士梅特勒-托利多），3336二氧化碳培养箱（美国Forma公司），OlympusIMT221倒置相差显微镜（日本Olympus公司），OlympusBH2显微镜（日本Olympus公司），DMiRB型荧光倒置显微镜（德国Leica公司），PH211C酸度计（意大利HANNA公司）等。（四）、方法1、取材心脏手术中建立体外循环心脏停跳前无菌条件下获取右心耳组织约30mg,放在装有无菌预冷PBS液的大EP管中，立即送实验室，置于盛预冷PBS液的培养皿中，用眼科虹膜剪剪去多余的外膜和脂肪，预冷PBS液清洗3次，去除血污，把心耳组织剪lmmxlmmxlmm的组织块备用。2、酶消化分离培养法组织碎块移入加有搅拌子的锥形瓶中，酶消化液冲洗剪刀及培养皿，转移至锥形瓶中。加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍，37°C水浴箱孵育，打开磁力搅拌器，60r/min搅拌10min，吸管轻轻吹打组织块lmin分散细胞，自然沉降2min后遗弃上清液。再次加入酶消化液10〜15ml消化10min。吸取上清液入离心管，加入预冷培养液2ml，吹打均匀后，1200r/min离心4min，弃上清，细胞沉淀加预冷的培养液吹打后用封口膜封口放于冰中备用。剩余组织块重复上述过程若干次，直到组织块消失，分次收获细胞。3、细胞培养将分次收获的细胞悬液集中离心1次，将所有细胞沉淀集中于一个离心管加适量培养液再离心1次。弃上清液加10ml含20%胎牛血清的DMEM培养液中，吹打几次以散开所有的细胞团接种于培养瓶中，置体积分数5%CO2、95%空气、37C培养箱中培养，放置1h差速贴壁，最先贴壁为心肌成纤维细胞，弃含有心肌细胞的未贴壁的细胞悬液，加10ml含20%胎牛血清的DMEM培养液中，继续培养心肌成纤维细胞，每2天换液1次。4、分离纯化心肌成纤维细胞在细胞培养中，心肌成纤维细胞具有分裂增殖能力，且生长迅速，贴壁较早，根据心肌成纤维细胞较心肌细胞贴壁速度较快的原理做差速分离去除心肌细胞。贴壁细胞基本为成纤维细胞.每天在显微镜下观察细胞，并及时更换细胞培养液。原代培养3〜5天左右，见细胞形态由长梭形逐渐变成圆形或长满瓶壁的80%以上即可进行传代培养。小心吸去瓶中原培养液，注意避免晃动及刮擦，加入2mlPBS清洗后（刚好浸没瓶壁），用1〜2ml含0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化约1〜2min，倒置显微镜下观察细胞收缩变圆后立即将消化液吸出，并加入2ml含20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞并制成细胞悬液，将所得细胞悬液按体积比1:2稀释后接种于新培养瓶进行传代，实验用第2〜3代细胞。5、细胞活力检测用体积分数4%的台盼兰染液进行活细胞拒染，加入细胞计数板中，立即置于100倍镜下，进行细胞活力检测，未被台盼兰染上蓝色的为活细胞。细胞成活率（%）=[（总细胞数-着色细胞数）/总细胞数x100%][2]。6、形态学观察倒置光学显微镜观察:在倒置光学显微镜下观察培养液色泽变化;观察心肌成纤维细胞生长状态、形态变化。7、心肌成纤维细胞的免疫荧光染色鉴定（1）、心肌成纤维细胞的Vimentin抗原鉴定取传2代心肌成纤维细胞以105个细胞接种于放有无菌盖玻片的6孔板，1-2天后用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入1ml固定液（4%多聚甲醛），固定30min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入封闭液1ml，在摇床上轻轻摇动封闭60min，滴加1：200稀释1ml小鼠波形蛋白抗体，室温孵育120min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；然后滴加1:1000稀释1ml荧光标记的抗小鼠Cy3结合小鼠波形蛋白，室温避光孵育60min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5min；最后把抗荧光淬灭封片液滴于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞接触封片液，荧光显微镜下观察。（2）、心肌成纤维细胞的a-SMA抗原鉴定取传2代心肌成纤维细胞以105个细胞接种于放有无菌盖玻片的6孔板，1-2天后用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入1ml固定液（4%多聚甲醛），固定30min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入封闭液1ml，在摇床上轻轻摇动封闭60min，滴加1：400稀释1ml小鼠a-SMA抗体，室温孵育120min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；然后滴加1:1000稀释1ml荧光标记的抗小鼠Cy3结合小鼠波形蛋白，室温避光孵育60min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5min；最后把抗荧光淬灭封片液滴于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞接触封片液，荧光显微镜下观察。（3）、心肌成纤维细胞的VWF抗原鉴定取传2代心肌成纤维细胞以105个细胞接种于放有无菌盖玻片的6孔板，1-2天后用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入1ml固定液（4%多聚甲醛），固定30min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入封闭液1ml，在摇床上轻轻摇动封闭60min，滴加1：800稀释1ml兔VWF抗体，室温孵育120min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；然后滴加1:1000稀释1ml荧光标记的抗兔FITC结合兔VWF抗体，室温避光孵育60min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5min；最后把抗荧光淬灭封片液滴于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞接触封片液，荧光显微镜下观察。二、结果（一）、台盼蓝排斥实验结果：经台盼兰染液进行活细胞拒染，测得细胞活力均在90%-95%。（二）、细胞形态学观察普通光学显微镜观察差速贴壁法最先贴壁的为心肌成纤维细胞，细胞呈不规则形或椭圆形，后变为长梭形，胞体平坦，体积较大，细胞核较大，椭圆形，经常含有2-3个核，培养过程中不发生自发性搏动（见照片1、2）。（三）、心肌成纤维细胞纯度鉴定细胞免疫荧光染色结果：可见细胞浆波形蛋白抗体、a-SMA抗体染色呈阳性，纯度大于95%（见照片3、4）。VWF抗体染色阴性。证实为人心肌成纤维细胞。附图三、讨论体外细胞培养模型对于心肌成纤维细胞与心肌纤维化研究实验的开展有着十分重要的作用，而本实验建立的人的心肌成纤维细胞培养模型，其结果比在动物模型上的研究更加可靠。目前心肌成纤维细胞的培养方法繁多，主要有胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶+胶原酶消化法、组织块法等。组织块培养法培养人心肌成纤维细胞虽然操作简便，细胞同源性好，纯度高，但部分组织块生长能力较差，培养的成活率较低，到可传代的时间较长，污染和感染的机会增加。而酶消化法是一种较为快捷的原代培养方法，利用消化酶将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等消化去除，使细胞分散，形成悬液，可以很快得到大量活细胞，细胞也可在短时间内贴壁生长成片。酶消化法常用有胶原酶+胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶消化法，由于心肌成纤维细胞其活力强，对环境要求偏低，故两种酶消化方法得到的原代心肌成纤维细胞从外形和纯度上都没有明显区别，而采用胶原酶+胰蛋白酶消化法时其中的胶原酶主要是对细胞间质的胶原纤维进行消化，在这一过程中，胶原蛋白酶消化心肌组织时也会对心肌成纤维细胞产生一定程度的影响[3]。本实验参照Gustafsson[4]的胰蛋白酶消化法及Neuss等】1]研究的差速贴壁分离培养方法，经过相关消化条件的改良，如原代培养时，只用浓度0.25%的胰蛋白酶，从某种程度上避免了胶原蛋白酶对心肌成纤维细胞的潜在损害，从而更好地保存了其自身增殖能力的特点；采取分时段分次收集细胞，避免活细胞长时间持续的接触消化酶，增加培养液胎牛血清浓度，由常用的10%增加为20%，这样既保证把组织块充分分离成细胞团或单个细胞，便于细胞从培养液中摄取营养和排出代谢物，又减少消化酶对细胞的化学损伤。Leslie等[5]发现，在心脏压力负荷过大导致心脏重构中，心肌成纤维细胞表型转变为肌成纤维细胞，大量表达a-SMA。Buniatian等[6]研究发现，a-SMA是肌成纤维细胞的标志蛋白，张月娥等[7]在器官纤维化的研究中发现，a-SMA可作为反映心肌成纤维细胞增生与ECM分泌的指标。对大量存在于成纤维细胞中的中间丝起反应的抗波形蛋白抗体(Anti-vim-entinantibodies)是成纤维细胞的一个有效的标记物[8]。Jaffe[9]研究认为VWF相关抗原免疫荧光检测，人体内除内皮细胞外仅在血小板和巨核细胞中存在因子VWF相关抗原，故可用于血管平滑肌和成纤维细胞相鉴别。本实验采用多次差速贴壁分离方法，传代后获得纯度高的心肌成纤维细胞，细胞免疫荧光染色结果：可见细胞浆波形蛋白抗体、a-SMA抗体染色呈阳性，VWF抗体染色阴性。结合形态学特征，证实为人心肌成纤维细胞。综上所述，在本研究以心脏手术中患者的右心耳组织为材料，采用胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法消化、分离、培养人心肌成纤维细胞，并通过特异性免疫荧光鉴定，建立了一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人成纤维细胞体外培养模型，为人心肌纤维化研究及人心肌成纤维细胞增殖模型的建立提供了一种方法。参考文献NeussM，Regitz-ZagrosekV，HildebrandtA&FleckE.Isolationandcharacterisationofhumancardiacfibroblastsfromexplantedadulthearts[J].CellandTissueResearch，1996，286:145-153.司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安:世界图书出版公司，1996:181.孙刚，薛睿等.新生大鼠心肌成纤维细胞培养方法的比较[J].中国病理生理杂志.10000-4718(2014)02-0308-05.GustafssonAB，BruntonLL.beta-adrenergicstimulationofratcardiacfibroblastsenhancesinductionofnitric-oxidesynthasebyinterleukin-1betaviamessagestabilization[J].Molecularpharmacology，2000，58(6)：1470.Leslie，KO，TaatjesDJ，etal.Cardiacmy