DB32-T 3762.12-2021 新型冠状簿检测技术规范 第12部分：药物体外抗簿效果测定

11.020C

62DB32

32/T

3762.12—2021新型冠状病毒检测技术规范第

12

部分：药物体外抗病毒效果测定Technical

specifications

SARS-CoV-2

detectionPart

12:In

of

2021

-

11

-

04

发布2021

-

12

-

04

实施江苏省市场监督管理局 发

布DB32/T

3762.12-2021 DB32/T

3762《新型冠状病毒检测技术规范》目前分为以下部分：——第1部分：生物样本采集、运输和保存；——第2部分：病毒分离与鉴定；——第3部分：核酸荧光PCR检测程序；——第4部分：重组酶介导等温扩增程序；——第5部分：血清和抗体酶联免疫吸附检测程序；——第6部分：血清和抗体胶体金免疫层析检测程序；——第7部分：空气样本检测与评估；——第8部分：物体表面检测与评估；——第9部分：医务人员职业暴露检测与评估；——第10部分：微量血清中和试验；——第11部分：全基因组高通量测序；——第12部分：药物体外抗病毒效果测定。本文件为DB32/T

3762

12部分。本文件按照GB/T

1.1-2020

给出的规则起草。本文件由江苏省卫生健康委员会提出。本文件由江苏省卫生标准化技术委员会归口。疾病预防控制中心。焰、张宏宾、张伟。DB32/T

3762.12-2021新型冠状病毒检测技术规范

第

12

1 范围要求、操作步骤和清场与消毒。本文件适用于新型冠状病毒药物体外抗病毒效果测定。2 规范性引用文件文件。DB32/T

3762.3

新型冠状病毒检测技术规范

第3部分：核酸荧光PCR检测程序新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册 中华人民共和国国家卫生健康委员会3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1细胞病变效应

effect，CPE乃至细胞裂解等。3.2感染复数

of

infection，MOI感染时病毒和细胞数量的比值。3.3半最大效应浓度

concentration，能引起50%最大效应的药物浓度。3.4半数细胞毒性浓度

concentration，对半数细胞产生毒性作用的药物浓度。3.5DB32/T

3762.12-2021最大无毒浓度

atoxic

，不引起细胞毒性的最大药物浓度3.6选择指数

index，SI为判断药物效果的安全范围，，选择指数越大，药物的安全范围越大。4 环境与设施4.1 实验室资质及级别要求应符合新型冠状病毒实验室生物安全指南的要求，病毒培养包括病毒的分离、培养、滴定等取得开展相应活动的资质。病毒核酸荧光PCR检测程序可参照

3762.3进行。4.2 操作人员资质及防护要求实验室进入资质和相关实验活动上岗证。操作人员在健康状态良好的情况下经实验室主任批准后方可开展活动，应根据新型冠状病毒实验室生物安全指南要求，按照个人防护的要求进行防护。5 设备与耗材5.1 设备CO荧光定量PCR仪、微量移液器等。5.2耗材N95PE手套、防水靴套、带滤芯头、一次性平皿、96孔细胞培养板、96孔PCR反应板等。6 试剂与材料6.1试剂6.1.1

Hanks

溶液（每毫升含青霉素、链霉素各

2000

6.1.2

DMEM

培养液（含

10

%胎牛血清）。6.1.3

DMEM

维持液（含

2

%胎牛血清）。6.1.4

消化液

（

%胰酶和

0.025

%

EDTA-Na6.1.5

核酸提取试剂盒。6.1.6

新型冠状病毒荧光

PCR

检测试剂盒。DB32/T

3762.12-20216.2 材料6.2.1新型冠状病毒培养物。6.2.2待检药物和阳性对照药物（瑞德西韦）。6.2.3 非洲绿猴肾传代细胞（VERO-E6）。7 技术要求7.1 滴度水平测定结果。7.2

CPE少试验、病毒抗原测定、病毒核酸测定等方法来判断，本文件通过病毒核酸测定来评价药物体外抗病毒效果。7.3 （中性红、MTT

或

CCK-8

等染色后测

OD

7.4 果观察。8 操作步骤8.1 药物对细胞的毒性测定8.1.1 将实验所需细胞于

℃

5

%

CO培养箱培养至单层，覆盖度

80%细胞培养液。8.1.2 待检药物稀释：将待检药物用细胞培养液做倍比稀释，使其稀释度分别为原液（选定浓度）、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，1:256，度溶液需要反复吹打混匀。8.1.3 分别取

200

μl

养孔中，每一稀释度接种

4

孔，置

37

℃

培养箱中培养。8.1.4

CPE

果，计算待检药物的最大无毒浓度（）和半数细胞毒性浓度（CC8.2 药物抗病毒效果测定8.2.1 将实验所需细胞于

孔培养板中置

℃

5

%

CO培养箱培养至单层，弃掉细胞培养液。8.2.2 待检药物稀释：将待检药物选用最大无毒浓度，用

DMEM

维持液做倍比稀释，使其稀释度分别为原液（最大无毒浓度）、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，每完成一个一稀释度必须更换吸头，每个稀释度溶液需要反复吹打混匀。8.2.3 阳性对照药物稀释：将阳性对照药物（瑞德西韦）从

10μM

原始浓度开始，按照和待检药物相同的稀释方法进行倍比稀释。8.2.4 分别取

50

μl

3

37℃

5%

养

1

h。8.2.5 将药物预处理后的细胞、病毒、药物、试剂和耗材一次性带入

核心区。计算公式为（ ）计算公式为（ ）×100

％（其中△CT=待检药物组

值-病毒对照组

值）。以病毒被抑制的8.2.6 在待检药物组、阳性对照药物组和病毒对照组的细胞孔中加入新型冠状病毒（2

μ孔，MOI），置

37

℃

5%

培养箱中培养吸附

1

h。8.2.7 弃培养上清，以

Hanks

液洗涤细胞

2

次后加入含有对应不同浓度药物的

维持液，病毒对照组和细胞对照组加不含药物的

DMEM

37

℃

5%

培养箱中培养

h。8.2.8

CPE核酸提取试剂的裂解液中，混匀后按照核酸提取试剂盒和核酸提取仪操作说明进行核酸提取。8.2.9核酸检测：参照

3762.3

进行。8.2.10

%eq

\o\ac(△,-)

性对照药物的

EC值，进一步计算待检药物的选择指数

SI（/

8.2.11

CPE

变化，原始浓度的阳性对照药物能够阻止

CPE

EC检药物的

SI

值，评估其体外抗病毒效果。9清场与消毒9.1

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