第章免疫学检测技术

第一节体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素本文档共89页；当前第1页；编辑于星期三\15点38分一.体外抗原抗体反应的特征

高度特异性：抗原的表位与抗体的抗原结合点结构互补。

表面化学基团之间的可逆性结合适宜的抗原抗体浓度和比例抗原抗体反应的两个阶段本文档共89页；当前第2页；编辑于星期三\15点38分高度专一性的结合本文档共89页；当前第3页；编辑于星期三\15点38分可逆性结合Equivalence–Latticeformation本文档共89页；当前第4页；编辑于星期三\15点38分抗原抗体比例对反应现象的影响本文档共89页；当前第5页；编辑于星期三\15点38分抗原抗体反应的影响因素电解质：可促进抗原与抗体的结合。常用生理盐水。温度：最适温度为37℃。酸碱度：最适pH=6-8。本文档共89页；当前第6页；编辑于星期三\15点38分第二节检测抗原或抗体的体外试验本文档共89页；当前第7页；编辑于星期三\15点38分（一）凝集反应颗粒性抗原（RBC、细菌等）与相应抗体结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。1．直接凝集试验玻片凝集试验：用于定性测抗原。如ABO血型鉴定，细菌的鉴定、分型等。试管凝集试验：用于定量测抗体，如肥达氏反应。

2．间接凝集试验如类风湿因子的测定等。本文档共89页；当前第8页；编辑于星期三\15点38分本文档共89页；当前第9页；编辑于星期三\15点38分（二）沉淀反应

可溶性抗原（血清蛋白、组织浸液等）与相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故又称为琼脂扩散试验或免疫扩散。

本文档共89页；当前第10页；编辑于星期三\15点38分琼脂凝胶本文档共89页；当前第11页；编辑于星期三\15点38分1．单向免疫扩散用于定量测抗原。如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。

本文档共89页；当前第12页；编辑于星期三\15点38分2．双向免疫扩散主要用于定性检测抗原或抗体，抗原组成及两种抗原相关性分析本文档共89页；当前第13页；编辑于星期三\15点38分3．免疫电泳

其方法是先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断

本文档共89页；当前第14页；编辑于星期三\15点38分（三）免疫标记技术免疫标记技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术本文档共89页；当前第15页；编辑于星期三\15点38分常用的标记物酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质及胶体金优点：极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要类型：免疫酶技术免疫荧光技术放射免疫测定法发光免疫分析免疫胶体金技术本文档共89页；当前第16页；编辑于星期三\15点38分1)免疫酶测定法（EnzymeImmunoassay,EIA）利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法特点：利用抗原-抗体反应的高度特异性，以及酶催化底物反应的生物放大作用,最后用酶标仪测定光密度值（OD），评定抗原-抗体的含量。本文档共89页；当前第17页；编辑于星期三\15点38分常用酶及其底物辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）

本文档共89页；当前第18页；编辑于星期三\15点38分分类本文档共89页；当前第19页；编辑于星期三\15点38分双抗体夹心法在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等本文档共89页；当前第20页；编辑于星期三\15点38分特点：非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇

本文档共89页；当前第21页；编辑于星期三\15点38分间接法ELISA乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法本文档共89页；当前第22页；编辑于星期三\15点38分2)免疫荧光技术

(ImmunofluorescenceTechnique)

用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法

本文档共89页；当前第23页；编辑于星期三\15点38分常用荧光素异硫氰酸荧光素（FITC），显黄绿色。藻红蛋白（PE），显红色。用途：细胞表面CD分子抗核抗体

本文档共89页；当前第24页；编辑于星期三\15点38分本文档共89页；当前第25页；编辑于星期三\15点38分本文档共89页；当前第26页；编辑于星期三\15点38分本文档共89页；当前第27页；编辑于星期三\15点38分3)放射免疫测定法（RIA）用放射性核素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法敏感度可达pg水平，其标记物为125I、131I等。常用于微量物质的检测，如激素、IgE等。

本文档共89页；当前第28页；编辑于星期三\15点38分4)发光免疫分析(luminescenceimmunoassay

LIA)将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量免疫分析技术。优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的高灵敏度。本文档共89页；当前第29页；编辑于星期三\15点38分化学发光免疫测定吖啶酯、鲁米诺生物发光免疫测定萤火虫、发光水母化学发光酶免疫测定辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）电化学发光免疫测定本文档共89页；当前第30页；编辑于星期三\15点38分5)免疫胶体金技术用胶体金标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法本文档共89页；当前第31页；编辑于星期三\15点38分6)免疫印迹法（Westernblotting）该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫技术测定。常用于检测多种蛋白质本文档共89页；当前第32页；编辑于星期三\15点38分免疫印迹法示意图本文档共89页；当前第33页；编辑于星期三\15点38分本文档共89页；当前第34页；编辑于星期三\15点38分4.蛋白质芯片技术：又称蛋白质微阵列是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。本文档共89页；当前第35页；编辑于星期三\15点38分原理：是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。本文档共89页；当前第36页；编辑于星期三\15点38分第三节免疫细胞功能的检测本文档共89页；当前第37页；编辑于星期三\15点38分本文档共89页；当前第38页；编辑于星期三\15点38分免疫细胞的分离外周血单个核细胞分离淋巴细胞的分离T细胞和B细胞的分离T细胞亚群的分离本文档共89页；当前第39页；编辑于星期三\15点38分(一)外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。

Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。本文档共89页；当前第40页；编辑于星期三\15点38分细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同本文档共89页；当前第41页；编辑于星期三\15点38分不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093

粒细胞密度为1.092

单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为

本文档共89页；当前第42页；编辑于星期三\15点38分用1.077±0.001的分层液可将细胞分离本文档共89页；当前第43页；编辑于星期三\15点38分密度梯度离心(Ficoll)离心本文档共89页；当前第44页；编辑于星期三\15点38分（二）淋巴细胞及其亚群的分离和分析免疫吸附分离法免疫磁珠法荧光激活细胞分离仪分离法（

(FluorescenceActivatedCellSorting)，

FACS

）抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL

本文档共89页；当前第45页；编辑于星期三\15点38分2.免疫磁珠细胞分离本文档共89页；当前第46页；编辑于星期三\15点38分本文档共89页；当前第47页；编辑于星期三\15点38分免疫磁珠法细胞分选过程本文档共89页；当前第48页；编辑于星期三\15点38分3.荧光激活细胞分离仪分离法流式细胞术(flowcytometry,FCM)

本文档共89页；当前第49页；编辑于星期三\15点38分全自动细胞分选系统本文档共89页；当前第50页；编辑于星期三\15点38分流式细胞分析仪本文档共89页；当前第51页；编辑于星期三\15点38分流式细胞仪的工作原理和基本结构待测细胞以单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色，放入样品管，吸入流动室。流动室充满IsoFlow

，作用：约束样品在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。本文档共89页；当前第52页；编辑于星期三\15点38分4.抗原肽-MHC分子四聚体是一种药品的名字，可应用于免疫学研究和检测、特异性免疫治疗以及疫苗疗效监测等多个方面本文档共89页；当前第53页；编辑于星期三\15点38分抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL本文档共89页；当前第54页；编辑于星期三\15点38分二细胞免疫功能检测T细胞功能测定B细胞功能测定本文档共89页；当前第55页；编辑于星期三\15点38分（1）T淋巴细胞增殖试验原理：淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松本文档共89页；当前第56页；编辑于星期三\15点38分1）形态学检查法本文档共89页；当前第57页；编辑于星期三\15点38分2）3H-TdR掺入法优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。本文档共89页；当前第58页；编辑于星期三\15点38分3H-TdR或125I-UdR掺入法本文档共89页；当前第59页；编辑于星期三\15点38分3）MTT比色法本文档共89页；当前第60页；编辑于星期三\15点38分(2)迟发型超敏反应检测本文档共89页；当前第61页；编辑于星期三\15点38分2.B细胞功能测定单扩ELISA速率比浊法测定各类免疫球蛋白含量抗体形成细胞测定本文档共89页；当前第62页；编辑于星期三\15点38分（2）溶血空斑试验原理：本文档共89页；当前第63页；编辑于星期三\15点38分临床应用与评价溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。

本文档共89页；当前第64页；编辑于星期三\15点38分

B细胞抗体形成功能的检测

——酶联免疫斑点法原理：本文档共89页；当前第65页；编辑于星期三\15点38分应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。本文档共89页；当前第66页；编辑于星期三\15点38分ELISPOT技术简介

酶联免疫斑点试验(Enzymelinkedimmunospotassay)

80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。本文档共89页；当前第67页；编辑于星期三\15点38分ELISPOT的基本原理

细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与酶标记（例如碱性磷酸酶）的亲和素结合。底物（BCIP/NBT，产物为蓝紫色）孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过酶联斑点分析系统对斑点分析后得出结果。本文档共89页；当前第68页；编辑于星期三\15点38分稳定、特异，且抗原用量少可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞ELISPOT检测抗体分泌本文档共89页；当前第69页；编辑于星期三\15点38分ELISPOT分析系统酶联斑点读板仪本文档共89页；当前第70页；编辑于星期三\15点38分3.细胞毒试验原理：靶细胞抗原T细胞观察杀伤活力致敏CTL靶细胞本文档共89页；当前第71页；编辑于星期三\15点38分淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞肿瘤细胞破坏51Cr释放测定γ射线意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力

（1）51Cr释放法本文档共89页；当前第72页；编辑于星期三\15点38分图15-2T细胞细胞毒试验示意图本文档共89页；当前第73页；编辑于星期三\15点38分（2）乳酸脱氢酶释放法本文档共89页；当前第74页；编辑于星期三\15点38分本文档共89页；当前第75页；编辑于星期三\15点38分（3）细胞染色法本文档共89页；当前第76页；编辑于星期三\15点38分本文档共89页；当前第77页；编辑于星期三\15点38分(4)凋亡细胞检测法细胞凋亡生理性凋亡病理性凋亡由遗传控制，受既定程序（或基因）调控的，是程序性的细胞死亡（programmedcelldeath,PCD）非遗传控制的的意外的细胞坏死（accidentalcelldeath）定义：凋亡定义：细胞坏死本文档共89页；当前第78页；编辑于星期三\15点38分细胞坏死（细胞被动性死亡）

细胞受到急性强力伤害时，立即出现的早期反应。是病理条件下细胞死亡的过程。细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀核染色质随机降解呈絮状,蛋白合成减少。细胞膜、溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起周围炎症细胞凋亡（细胞主动性死亡）多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动性死亡过程。又称程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD).

从严格的词学意义上来说，PCD与凋亡是有很大区别的本文档共89页；当前第79页；编辑于星期三\15点38分细胞坏死细胞凋亡本文档共89页；当前第80页；编辑于星期三\15点38分细胞凋亡检测方形态学方法电泳法原位缺口末端标记法流式细胞术测定法本文档共89页；当前第81页；编辑于星期三\15点38分形态学方法

细胞坏死细胞凋亡本文档共89页；当前第82页；编辑于星期三\15点38分电泳法在细胞凋亡时，内源性mg2+、ca2+依赖性核算内切酶被激活，对DNA的切割有3种形式。即核小体间DNA链的断裂、大分子DNA链的断裂以及DNA单链的断裂。琼脂糖凝胶电泳时，可观察到特征的‘梯状’（ladder）DNA条带本文档共89页；当前第83页；编辑于星期三\15点38分TdT-mediateddUTP-biotinnickendlabeling(TUNEL)细胞凋亡有一项重