上课：课题3-血红蛋白的提取和分离

蛋白质(protein)是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类(zhǒnglèi)很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸(Aminoacid)按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。蛋白质的重要性第一页，共三十一页。精选课件血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要(zhǔyào)成分，负责运输O2和CO2第二页，共三十一页。精选课件课题(kètí)3血红蛋白的提取和分离第三页，共三十一页。精选课件一、基础知识（一）蛋白质提取和分离(fēnlí)的原理

（二）蛋白质提取和分离的方法

1、凝胶色谱法（分配色谱法）

2、电泳法（三）缓冲溶液二、实验操作——蛋白质的提取和分离第四页，共三十一页。精选课件

根据蛋白质的物理化学性质差异(chāyì)：

1.分子的形状、大小

2.电荷性质和多少

3.溶解度

4.吸附性质

5.对其他分子亲和力

（一）思考：蛋白质的种类多种多样，进行(jìnxíng)蛋白质提取与分离的原理是什么？第五页，共三十一页。精选课件1、凝胶色谱法（分配(fēnpèi)色谱法）小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程(lùchéng)长，流动慢；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快。

凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多(xǔduō)贯穿的通道。根据

分离蛋白质的方法。（1）概念：（2）材料：（3）原理：（二）蛋白质提取和分离的方法相对分子质量的大小第六页，共三十一页。精选课件第七页，共三十一页。精选课件洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子

第八页，共三十一页。精选课件2、电泳(diànyǒnɡ)法（2）原理(yuánlǐ)：

带电粒子在电场(diànchǎng)的作用下发生迁移的过程。（1）电泳：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。（二）蛋白质提取和分离的方法第九页，共三十一页。精选课件

电泳(diànyǒnɡ)原理示意图第十页，共三十一页。精选课件思考：影响(yǐngxiǎng)蛋白质分子运动速度的因素

决定运动方向电场作用力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√第十一页，共三十一页。精选课件（3）常见(chánɡjiàn)电泳方法有哪些？琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳（4）实例(shílì)

通常(tōngcháng)使用：十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量。①应用第十二页，共三十一页。精选课件（三）缓冲溶液(huǎnchōnɡrónɡyè)

抵制(dǐzhì)外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成，如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。调节缓冲剂的使用(shǐyòng)比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。1、作用：

2、配制：第十三页，共三十一页。精选课件二、实验操作(cāozuò)－－实验步骤1.洗涤红细胞

2.释放血红蛋白

3.分离血红蛋白

透析样品处理纯化纯度鉴定粗分离

凝胶色谱法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳谱法第十四页，共三十一页。精选课件血液(xuèyè)第十五页，共三十一页。精选课件血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个a－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团血液(xuèyè)的组成第十六页，共三十一页。精选课件二、实验(shíyàn)操作－－实验(shíyàn)步骤1.洗涤红细胞

2.释放血红蛋白

3.分离血红蛋白

样品(yàngpǐn)处理第十七页，共三十一页。精选课件1.洗涤

红细胞阅读(yuèdú)思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？血液(xuèyè)100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至(zhízhì)上清液没有黄色？第十八页，共三十一页。精选课件2.释放(shìfàng)血红蛋白阅读思考：释放(shìfàng)血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？作用是什么？搅拌的目的是什么？分析：蒸馏水的作用(zuòyòng)是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂第十九页，共三十一页。精选课件滤纸过滤脂类物质3.分离(fēnlí)血红蛋白红细胞混合液高速离心10min烧杯有机溶剂血红蛋白分液漏斗第二十页，共三十一页。精选课件20mmol/L磷酸缓冲液4.透析透析的目的(mùdì)是什么？1mL1mL1mL

去除样品中的分子(fēnzǐ)较小的杂质。第二十一页，共三十一页。精选课件第二十二页，共三十一页。精选课件纯化(chúnhuà)－－凝胶色谱法1.凝胶色谱(sèpǔ)柱的制作：2.凝胶色谱(sèpǔ)柱的装填：3.样品的加入和洗脱教材P68图5-19第二十三页，共三十一页。精选课件注意：装填(zhuānɡtián)尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。

思考：你能从凝胶色谱的分离原理(yuánlǐ)分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀，无气泡？扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离(fēnlí)效果。第二十四页，共三十一页。精选课件3.样品的加入(jiārù)和洗脱

1.调液面2.加样3.再调液面

4.洗脱(xǐtuō)

5.收集(shōují)缓冲液凝胶第二十五页，共三十一页。精选课件正确的加样操作(cāozuò)是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。第二十六页，共三十一页。精选课件讨论(tǎolùn)：答：除去(chúqù)相对分子量较大的蛋白质。1、纯化的目的(mùdì)是什么？答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。2、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？第二十七页，共三十一页。精选课件知识(zhīshi)总结血红蛋白(xuèhóngdànbái)的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定第二十八页，共三十一页。精选课件例题:

红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳。我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题(wèntí)：（1）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：

、

、

和

。（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。①加入柠檬酸钠的目的是

。②以上所述的过程即是样品处理，它包括

、

、收集血红蛋白溶液。第二十九页，共三十一页。精选课件（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。

①透析的目的是

。

②透析的原理是

。

（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行(jìnxíng)纯度鉴定。

①样品纯化的目的是

。

②血红蛋白有什么特点:

这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？

第三十页，共三十一页。精选课件内容(nèi