第三章蛋白质化学课件

第三章蛋白质化学一、什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。概述二、蛋白质的生物学重要性(一)特点分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。(二)、蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是生物体重要组成成分2.蛋白质具有重要的生物学功能1）催化生物化学反应（酶）2）结构成分(结缔组织的胶原蛋白、皮肤的弹性蛋白、膜蛋白)3）贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）4）物质运输（血红蛋白、脂蛋白、电子传递体）5）细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）6）激素功能（胰岛素）7）防御功能（抗体、血凝蛋白）8）接受传递信息（受体蛋白、味觉蛋白）9）调节细胞生长、分化和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）3.氧化供能1.按组成分类

﹡单纯蛋白质

这类蛋白质只含有-氨基酸组成，不含其它成分。例如：RNA酶、血清清蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白、角蛋

白等。

﹡结合蛋白

由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，这些非蛋白成分包括糖、脂、核酸、色素等，又称为辅基或配体。糖蛋白：如细胞膜中的糖蛋白等。脂蛋白：如血清-，-脂蛋白等。

核蛋白：如细胞核中的核糖核蛋白等。

色蛋白：如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。（三）、蛋白质的分类2.按蛋白质的外形分类

﹡球状蛋白质

外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。但肌动蛋白属于球状蛋白却不溶于水。

﹡纤维状蛋白质分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。

不溶性纤维状蛋白质：大多数纤维状蛋白质属此类，如胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白等。可溶性纤维状蛋白质：肌球蛋白和血纤蛋白原可溶于水。3.按多肽链条数分类

﹡单体蛋白质:仅含一条多肽链。

﹡多聚蛋白质:含两条或多条多肽链。

牛核糖核酸酶：一条多肽链

胰岛素：两条（两种）多肽链

血红蛋白：四条（两种）多肽链

牛核糖核酸酶血红蛋白胰岛素第一节一、组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。

各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%

蛋白质元素组成的特点二、蛋白质的基本单位-氨基酸

存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外）。一、氨基酸的结构氨基酸的结构通式或氨基酸是含有氨基的羧酸，不同氨基酸的R基不同，（除脯氨酸外）都为L-α-氨基酸。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R据R基团化学结构分类

脂肪族ＡA（16种）芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)杂环ＡＡ(His、Pro)据R基团极性分类极性R基团AA非极性R基团AA不带电荷带电荷带正电荷（３种）带负电荷（２种）据酸碱性质分类中性ＡＡ（一氨基一羧基）酸性ＡＡ(一氨基二羧基)Glu、Asp碱性ＡＡ（二氨基一羧基）Lys、His、Arg据营养学分类

必需ＡＡ非必需ＡＡ

人的必需氨基酸MetTrpLysValIleLeuPheThr假设来借一两本书

Arg、HisTrp、Cys二、基本氨基酸的分类甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00缬氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98

异亮氨酸

isoleucineIleI

6.02

苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非极性側链氨基酸目录色氨酸

tryptophanTryW

5.89丝氨酸

serineSerS

5.68酪氨酸

tyrosineTryY

5.66

半胱氨酸

cysteineCysC

5.07

蛋氨酸

methionine

MetM

5.74天冬酰胺

asparagineAsnN

5.41

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

5.65

苏氨酸

threonineThrT5.602.非电离极性側链氨基酸目录天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22赖氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76组氨酸

histidineHisH

7.593.酸性氨基酸4.碱性氨基酸目录几种特殊氨基酸

脯氨酸（亚氨基酸）

羟脯氨酸HO

半胱氨酸+胱氨酸二硫键-HH含羟基氨基酸含硫氨基酸非编码的蛋白质氨基酸也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。（1）4-羟脯氨酸

（2）5-羟赖氨酸这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。

（3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中）

(4)г-羧基谷氨酸存在于凝血酶原及某些具有结合Ca2+离子功能的蛋白质中。

（5）Tyr的衍生物：3.5-二碘酪氨酸、甲状腺素（甲状腺蛋白中）（6）锁链素由4个Lys组成（弹性蛋白中）。非蛋白质氨基酸不组成蛋白质，但有生理功能（1）L-型α–氨基酸的衍生物L-瓜氨酸、L-鸟氨酸是尿素循环的中间物（2）D-型氨基酸D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）（3）β-、γ-、δ-氨基酸β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）。氨基酸的功能：（1）、组成蛋白质（2）、一些aa及其衍生物充当化学信号分子-氨基丁酸，色氨酸衍生物：5-羟色胺、褪黑激素，都是神经递质，甲状腺素（Tyr衍生物），吲哚乙酸（Trp衍生物）都是激素（3）、氨基酸是许多含N分子的前体物核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要aa（4）、一些基本氨基酸和非基本aa是代谢中间物精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸)尿素循环的中间物，成年人：Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Lys、Met

婴儿期：Arg和His供给不足，属半必须氨基酸必需氨基酸第二节氨基酸的性质一、氨基酸的构型、旋光性和光吸收构型：组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。

以丙氨酸为例：

如含两个手性碳原子，则有４种立体异构体，分别称为Ｄ-,Ｌ-，Ｄ别-和Ｌ别-氨基酸。

L-苏氨酸(L-threonine)

D-苏氨酸(D-threonine)

L-别-苏氨酸(L-allo-threonine)

D-别-苏氨酸(D-allo-threonine)

如含两个手性碳原子，则有４种立体异构体，分别称为Ｄ-,Ｌ-，Ｄ别-和Ｌ别-氨基酸。L-苏氨酸(L-threonine)D-苏氨酸(D-threonine)L-别-苏氨酸(L-allo-threonine)D-别-苏氨酸(D-allo-threonine)

如含两个手性碳原子，则有４种立体异构体，分别称为Ｄ-,Ｌ-，Ｄ别-和Ｌ别-氨基酸。2L,3D2D,3L2L,3L2D,3D自然界中组成蛋白质的氨基酸都是L-型。(Gly除外)旋光性：

组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，

所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的称右旋，用“＋”号表示。是AA的物理常数，与结构、PH值有关。

消旋外消旋内消旋光吸收：组成蛋白质的氨基酸中，Trp、Tyr和Phe对紫外光有一定的吸收，这是因为它们分子中含有苯环，是苯环的共轭双键造成的，这三个氨基酸的光吸收都在280nm附近。

pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI带电荷为零带电荷为正带电荷为负完全质子化完全去质子化兼性离子二、氨基酸的两性解离及等电点(pK´1)(pK´2)不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在！

氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。等电点(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，在电场中既不向阳极也不向阴极移动。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。氨基酸等电点的特点：

1.净电荷数等于零，在电场中不移动；2.此时氨基酸的溶解度最小。氨基酸等电点的确定：根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算：等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。pI=————pK1+pK22或（pI=————）pK2+pK32酸性氨基酸，以Asp为例：碱性氨基酸，以Lys为例：pH>pI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO-，向正极移动。pH=pI时，氨基酸净电荷为零pH<pI时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-NH3+，向负极移动。

成盐成酰氯成酯成酰胺还原成盐与亚硝酸反应与甲醛反应酰化烃基化三、氨基酸的化学反应（1）与HNO2的反应（1）与HNO2的反应（2）与茚三酮的反应：

脯氨酸产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（0.5-50μg/ml）。(3)与甲醛反应：氨基酸的甲醛滴定法OH中和滴定

反应特点A.为α-NH2的反应B.在常温，中性条件，甲醛与α-NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。应用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法（间接滴定）A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。

反应特点A.为α-NH2的反应B.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。

首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构。(4)与2,4-二硝基氟苯（DNFB）的颜色反应（黄色）

(5)与苯异硫氰酸酯（PITC）的反应由Edman于1950年首先提出为α-NH2的反应苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），无色，可以用层析法分离鉴定。用于N末端分析，又称Edman降解法+胱氨酸二硫键-HH（6）半胱氨酸的氧化与还原反应（7）与醛反应西夫碱反应（Schiff’sbase）苄氧甲酰氯（carbobenzyloxychloride,Cbz-cl)叔丁氧甲酰氯对-甲苯磺酰氯邻苯二甲酸酐多肽的人工合成中被用作氨基保护剂。（8）酰化反应★丹磺酰氯（DNS-cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。NGly—Ala—Ser—Leu—PheC→→DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—PheC水解DNS—Gly、Ala、Ser、Leu、PheDNS-AA在紫外光激发后发黄色荧光。

α-羧基参加的反应成盐、成酯反应成酰氯的反应

氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰氯，使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。叠氮反应活化羧基，可用于肽的人工合成脱羧基反应 Glu脱羧形成γ-氨基丁酸

第三节氨基酸混合物的分离与测定一、层析技术

纸层析、薄层层析、离子交换层析、高效液相层析二、电泳技术

一、层析技术

层析技术又称色谱技术（Chromatography），是一种根据被分离物质的物理、化学及生物学特性的差异，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。

1.层析技术的分类根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。

根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。

根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。

吸附层析是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。

分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。

凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。

离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。

亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和底物、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。原理：组成层析系统的固定相和流动相具有相反的极性。被分析的样品（如aa混合物）中的各组分依据其自身极性的强弱，与此两相的亲和力不同。与固定相亲和力大者，易留滞于原地，与流动相亲和力大者，易随流动相移动，因而达到分离的目的。2.分配层析（1）纸层析

单向纸层析迁移率：Rf

双向纸层析图

（2）薄层层析

2．离子交换层析

原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。

离子交换原理及流程示意图+

树脂是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物。

洗脱顺序主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性、非极性有关。阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H（强酸型），羧基-COOH（弱酸型）

阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(CH3)3OH-

基本步骤：

装柱

上样

分步洗脱

分步收集强酸型阳离子交换树脂pH2~3，使所有氨基酸带正电荷，正电荷大小顺序：碱性AA>中性AA>酸性AA逐步提高洗脱液pH和离子强度高效液相层析（highperformanceliquidchromatography)电泳法（electrophoresis)第四节肽一、肽(peptide)和肽键(peptidebend)的概念二、肽的重要性质

酸碱性质、重要化学反应类似于氨基酸性质三、天然存在的活性肽生理活性肽的功能类别：激素、抗菌素、辅助因子实例：谷胱甘肽(glutathione,GSH)

短杆菌肽

促甲状腺素释放因子（TRH）

-天冬氨酸-苯丙氨酸甲酯（甜味剂）+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键肽和肽键的形成肽单位肽键肽平面*肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……*

肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有两端*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。N末端C末端牛核糖核酸酶几种生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+

体内许多激素属寡肽或多肽

神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及活性肽抗利尿素与催产素(9肽)、胰高血糖素（29肽）、脑啡肽（5肽）、降钙素（32肽）、ACTH（39肽）、胰岛素（51肽）肌肽（2肽）、P物质（10肽、属神经肽类）、β内啡肽（31肽）蛋白质的分子结构

TheMolecularStructureofProtein

第六、七节蛋白质的分子结构蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大蛋白质的分子结构包括

一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构一级结构：

肽链中氨基酸的排列顺序。

维系一级结构的主要化学键：肽键。二级结构：

肽链有规则地旋转或折叠形成的空间结构。维系一级结构的主要化学键：氢键。三级结构：

螺旋形的肽链非几何状地进一步折叠或卷曲而形成的更复杂的空间结构。维系力：盐键、疏水作用、范德华力等次级键。四级结构：

两条及两条以上肽链形成的蛋白质分子，结构共价单位为亚基或亚单位。亚基和亚基的结合方式为四级结构。维系力：盐键、疏水作用、范德华力等次级键。价键理论基本要点与共价键的特点价键理论基本要点：●能量最低原理：自旋相反的未成对电子配对成键后放出能量，使体系量降低。放出能量越多，键越稳定。●电子配对原理：两原子接近时，自旋相反的未成对电子可以配对形成共价键（形成条件）●原子轨道最大重叠原理：原子轨道尽可能按最大程度重叠，轨道重叠越多，电子在核间的几率密度越大，健越牢，分子越稳定。极性键和非极性键1、非极性键：

两个成键原子吸引电子的能力

（电负性

），共用电子对

偏移的共价键相同

不发生相同2、极性键：

两个成键原子吸引电子的能力

（电负性

），共用电子对

偏移的共价键不同

发生不同二硫键：又称S－S键。是2个SH基被氧化而形成的—S—S—形式的硫原子间的键。实质上是一种共价键。牛核糖核酸酶氢键的形成条件：分子中有H和电负性大、半径小且有孤对电子的元素(F，O，N)形成氢键。①键长特殊：F－HF270pm②键能小E(F－HF)28kJ·mol－1③具有饱和性和方向性。氢键的特点：氢键：强极性键上的氢核与电负性大、半径小含孤电子对并带有部分负电荷的原子间的静电引力。除了HF、H2O、NH3有分子间氢键外，在有机羧酸、醇、酚、胺、氨基酸和蛋白质中也有氢键的存在。例如：甲酸靠氢键形成二聚体。HCOOHHOOHC

除了分子间氢键外，还有分子内氢键。例如，硝酸的分子内氢键使其熔、沸点较低。离子键：成键微粒：阴阳离子相互作用：静电作用（静电引力和斥力）成键过程：阴阳离子接近到某一定距离时，吸引和排斥达到平衡，就形成了离子键。含有离子键的化合物就是离子化合物。1）当活泼金属的原子与活泼的非金属原子相互化合

时，均有通过得失电子而达到稳定电子构型的倾向；2）原子间发生电子转移而形成具有稳定结构的正负

离子，正负离子之间依靠静电作用相互吸引，形成离子键。Na+Cl－电子转移不稳定稳定21+118Na2+118Na++17287+17288ClCl-

分子间具有吸引作用的根本原因：任何分子都有正、负电中心；任何分子都有变形的性能。分子间作用（范德华力）1.取向力（趋向力)：

两个固有偶极间存在的同极相斥、异极相吸的定向作用称为取向力。分子离得较远趋向诱导影响因素？诱导力◆分子的极性越大，则取向力越大；◆温度越高，则取向力越小；◆分子间距离越大，则取向力越小。存在于极性分子与极性分子间2.诱导作用(诱导力)：决定诱导作用强弱的因素：极性分子的偶极矩：μ愈大，诱导作用愈强。非极性分子的变形性：变形性愈大，诱导作用愈强。·分子间距离↓，诱导力↑诱导偶极与极性分子永久偶极间的作用力。分子离得较远分子靠近时存在于：极性分子与非极性分子之间；

极性分子与极性分子之间；非极性分子的瞬时偶极之间的相互作用由于瞬时偶极而产生的分子间相互作用。3.色散作用(色散力)：一大段时间内的大体情况色散力与分子变形性有关。变形性大,色散力大。分子间距离越小，色散力越大。每一瞬间思考存在于一切原子、离子、分子之间。疏水作用：hydrophobicinteraction定义：非极性分子间或分子的非极性基团间的吸引力，导致这些基团在水性环境中的缔合。.概念：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。一、蛋白质的一级结构.主要的化学键(主键)肽键，有些蛋白质还包括二硫键。

1.蛋白质的一级结构(Primarystructure)包括：(1)组成蛋白质的多肽链数目.(2)多肽链的氨基酸顺序，(3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。★其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。线性结构，没有分枝：氨基酸之间由肽键连接

方向性：一条肽链的两端有不同结构和性质多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。书写时，N端在左侧，C端在右侧如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln.提示：一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。它由遗传密码决定,其上有酶切位点,一级结构可测定,并不同种属间有同源性.目录A.样品必需纯（>97%以上）；B.知道蛋白质的分子量；C.知道蛋白质由几个亚基组成；D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。(2)测定步骤

①多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).2.蛋白质的一级结构的测定(1)测定蛋白质的一级结构的要求

②测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。

③二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。④测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；⑤分析多肽链的N-末端和C-末端

二硝基氟苯（DNFB）法丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。多肽链端基氨基酸分为两类，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸测定的主要方法有：末端氨基酸的测定肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。

氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。⑥多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽的选择性降解的方法有：⑦测定每个肽段的氨基酸顺序。⑧确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。⑨确定原多肽链重二硫键的位置：一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。二、蛋白质的高级结构指蛋白质分子空间的结构,即立体,空间的构象，在蛋白质分子中各元素围绕某些化学键进行旋转,从而形成各种空间排布及相互关系构型：

在一个具有不对称的化合物不对称中心上的几个原子或基团的排列方式。经过旋转不能重合。构象：分子上原子沿共价键旋转而产生的不同空间结构。经过旋转可以重合。D-甘油醛L-甘油醛

肽键

肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。CNOH参与肽键的6个原子C1、、C、O、N、H、C2位于同一平面，，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元

(peptideunit)

。肽平面的键长键角一定肽键平面(肽单元,肽平面,酰胺平面)是蛋白质的基本结构单位.肽键平面—形成二级结构的基础肽单位Cα所连的两个键可以旋转。两个肽平面形成二面角2.二级结构的概念与基本形式A.概念:一条多肽链中局部原子的空间排布B.它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键C.二级结构的基本形式（1）

-螺旋(-helix)

（2）

-折叠(-pleatedsheet)（3）

-转角(-turn)（4）不规则卷曲(randomcoil)

α螺旋特点①多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构螺旋一圈沿轴上升的距离称为螺距，固定为0.54nm，包含3.6的AA，每个AA之间的距离为0.15nm。②肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键③α螺旋为右手螺旋RRRRRRRRR-折叠特点：①-折叠的肽链几乎是完全伸展的，成一种折叠的形式。所以强度更大，更具刚性，更硬。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。②Cα处于折叠的角上，R键处于棱角上并与棱角垂直。两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm。③-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。④平行式：N末端在一端反平行式：N末端在两端NCNCNCNC维系力:链内或链间氢键-转角-转角β-转角

①180°的转角部位②由4个氨基酸残基构成③由第一个残基的羰基氧（O）与第四个残基的氨基氢（H）形成氢键④多含脯氨酸和甘氨酸不规则卷曲环或卷曲结构：无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。相对没有规律性的排布，但是其同样表现重要生物学功用。二级结构的维系力:氢键.氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构。（１）超二级结构在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。★超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域．超二级结构和结构域.模体在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。钙结合蛋白中结合钙离子的模体

锌指结构

对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称结构域。结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。结构域一般由100~200个氨基酸残基组成，但大小范围可达40~400个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的．结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上．结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性．结构域★结构域与功能域的关系：有时一个结构域就是蛋白质的功能域，但不总是．包含一个但通常是多个结构域(二)、蛋白质的三级结构氢键、离子键、疏水键、VanderWaals力等。2.主要的化学键（维系力）一条多肽链中全部氨基酸残基(全部元素)的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。包括主链，側链的全部内容1.概念为非共价键，次级键（盐键）

肌红蛋白(Mb)肌红蛋白为单肽链蛋白质，含153个氨基酸残基，它含有8个α螺旋区，依次称为A到H螺旋，并含有β转角及环-卷曲等二级结构。

2.维系力亚基之间的结合力有疏水作用，VanderWaals力以及氢键和离子键,还有二硫键。（三）蛋白质的四级结构(或蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。)1.概念有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的四级结构.而每条多肽链被称为亚基(subunit)。.蛋白质的四级结构具有四级结构蛋白质Summary维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键a盐键（离子键）b氢键c疏水相互作用力d范德华力e二硫键f酯键第八节几种典型蛋白质一、纤维类蛋白质1α角蛋白：毛、发、蹄、爪、羽毛、甲壳、指甲等。富含胱氨酸。主要是α螺旋结构。

β角蛋白：蜘蛛和蚕的丝纤维、爬行类的鳞片、爪、喙中。主要是β折叠结构。2丝蛋白蚕丝中。主要反平行β折叠结构。3胶原蛋白

胶原蛋白

胶原纤维二、球蛋白

结构最复杂、功能最多的一大类蛋白质。如血红蛋白。三、糖蛋白四、脂蛋白第九节、蛋白质结构与功能的关系(一)、蛋白质的一级结构与功能的关系

(二)、蛋白质的空间结构与功能的关系.一级结构是空间构象的基础(一)、蛋白质一级结构与功能的关系牛核糖核酸酶的一级结构二硫键血红蛋白珠蛋白：α和β，各二血红素：鉄卟啉（亚铁）正常人的红细胞镰刀状红细胞正常的血红蛋白镰刀状红细胞的血红蛋白镰刀状贫血病基因高频地区恶性疟疾流行地区同源蛋白

同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近.例：细胞色素C60个物种中，有27个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基.可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）.黄色：不变残基（invariableresidues）蓝色：保守氨基酸（conservativeresidues）未标记：可变残基（variableresidues）对比不同动物的血红蛋白之氨基酸序列,可以表现不同动物间的亲缘关系..肌红蛋白Mb与血红蛋白Hb的结构(二)、蛋白质空间结构与功能的关系目录Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。.血红蛋白的构象变化与结合氧肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线*协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应

(negativecooperativity)变构效应(allostericeffect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。可逆变性不可逆变性尿素天然核糖核酸酶巯基乙醇松散核糖核酸酶变性核糖核酸酶天然核糖核酸酶除去巯基乙醇除去尿素除去尿素除去巯基乙醇（加入氧化剂）蛋白变性：Anfinsen实验

去除尿素，

加入微量的巯基乙醇牛胰核糖核酸酶RNaseA.蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人皮质-纹状体-脊髓变性病（克雅病）、老年痴呆症（阿尔茨海默病）、亨廷顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病PrPcPrPscPrPcPrPsc

α－螺旋40％21％

β－折叠

3％54%

溶解性可溶不溶

聚合状况单体多聚

细胞定位细胞表面胞质

蛋白酶水解完全局部

侵染性无感染性侵染性PrPC与PrPSC的氨基酸序列完全一样，高级结构不一样搔痒病PrP正常PrP原有的PrP分子转化了的PrP分子蛋白质的变性与复性变性：某些物理化学作用下，蛋白质空间结构解体，失去活性称为变性。一定条件下变性蛋白质空间结构恢复，称为复性。破坏的化学键：氢键、疏水键、范德华力等次级键。有些可以复性，有些不可复性。第十节蛋白质的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofProtein蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。一、蛋白质两性解离和等电点

PrCOOHNH3+OH-H+PrNH3+COO_OH-PrH+NH2COO-正离子pH＜pI两性离子pH﹦pI负离子pH＞pI蛋白质等电点ProteinpI胃蛋白酶<1.0血清蛋白4.9尿素酶5.0血色素6.8肌血球素7.0糜蛋白酶原9.5溶解酵素11.0二.蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚合沉淀三.蛋白质的变性、沉淀和凝固*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。

引起变性的因素:物理、化学与生物学因素如如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。

变性的本质——

破坏非共价键（次级键）和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。变性蛋白质的特点:

粘度增加，溶解度降低，易沉淀,易被蛋白酶降解,丧失生物学活性.

应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

四、蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。（与TrpTyr有关）五、蛋白质的呈色反应⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)

蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。⒉