实验四福林酚试剂法测定血清总蛋白

实验四福林酚试剂法测定血清总蛋白第1页，课件共27页，创作于2023年2月

学习测定蛋白质浓度的测定方法学习绘制标准曲线及用标准曲线求待测物质含量的方法实验目的第2页，课件共27页，创作于2023年2月蛋白质浓度测定双缩脲法微量凯氏定氮法Folin-酚试剂法紫外吸收法实验原理

第3页，课件共27页，创作于2023年2月双缩脲反应：在碱性条件下，双缩脲可与铜离子结合生成紫红色化合物。

双缩脲法测定蛋白质H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2H2N-CO-NH-CO-NH2

＋NH3双缩脲第4页，课件共27页，创作于2023年2月具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，颜色深浅与其浓度成正比，可用比色法进行测定。本法操作简单，重复性好，干扰物质少。但缺点是灵敏度较低测定蛋白质范围为1-10mg第5页，课件共27页，创作于2023年2月微量凯氏定氮法含氮化合物与浓硫酸共热分解产生氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。硫酸铵在强碱作用下分解生成氨；用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，所用无机酸的量相当于被测样品中氨的量，从而可计算样品的含氮量。蛋白质含氮量通常在16%左右，将测得的含氮量乘上6.25，便得到该样品的蛋白质含量。第6页，课件共27页，创作于2023年2月

Folin—酚试剂法(Lowry法)Step1碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质－铜复合物蛋白质－铜复合物使磷钨酸—磷钼酸还原蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可使酚试剂中的磷钨酸—

磷钼酸还原而呈蓝色显色反应(蓝色)。在一定条件下，蓝色强度(A660)与蛋白质的量成正比例Step2第7页，课件共27页，创作于2023年2月优点:

缺点:操作简便灵敏度高有蛋白质特异性的影响；受多种因素干扰可检测的最低蛋白质量达5µg/ml，通常测定范围是25-250µg/ml

第8页，课件共27页，创作于2023年2月干扰物质蔗糖Tris缓冲液硫酸胺酚类尿素柠檬酸胍硫酸钠三氯乙酸乙醇丙酮CHAPSEDTAEGTAHEPESTritonX-100dithiothreitol第9页，课件共27页，创作于2023年2月实验器材与试剂大试管、刻度吸量管、恒温水浴箱

722E型分光光度计试剂甲，试剂乙标准蛋白溶液（250μg/ml）待测血清（稀释500倍）第10页，课件共27页，创作于2023年2月空白(1)(2)(3)(4)(5)(6)待测管（7）标准蛋白溶液(250µg/ml)--0.20.40.60.81.0—待测血清——————1.0蒸馏水1.00.80.60.40.20--试剂甲3.03.03.03.03.03.03.0取7支洁净试管，按下表加入试剂

实验步骤第11页，课件共27页，创作于2023年2月混匀后室温放置20分钟在各试管中分别加入试剂乙0.3mL30分钟后以空白管为对照测其吸光值(660nm)立即摇匀第12页，课件共27页，创作于2023年2月标准曲线法标准管对照法

计算及绘制标准曲线第13页，课件共27页，创作于2023年2月朗伯比尔定律：A=εclε：摩尔吸光系数

c：溶液的浓度

l：液层的厚度

A：物质的吸光度

当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理---朗伯-比耳定律

第14页，课件共27页，创作于2023年2月

标准曲线法在分光光度计测定范围内，配制一系列已知不同浓度的标准溶液，在特定波长条件下分别测出其吸光度值。以吸光度值为纵坐标，相应的溶液浓度为横坐标在坐标纸上作出一条吸光度与浓度成正比，并且通过原点的直线，即标准曲线，也称C-A曲线第15页，课件共27页，创作于2023年2月＊＊＊＊＊CA标准曲线CXAX

CX为根据待测样品的吸光值查标准曲线所得的蛋白质浓度0C2C3C4C5C6A2A3A4A5A6第16页，课件共27页，创作于2023年2月在图上查出待测管的浓度后，按下列公式进行计算：待测血清蛋白含量=C7×4.31（g/L）×500M7（μg）×5001000或者=第17页，课件共27页，创作于2023年2月注意事项

作一条标准曲线至少要5个点被测物与标准物应在相同条件下测定标准曲线中标准物浓度有一定的线性范围，应使标准曲线范围在被测物质浓度的1/2～2倍之间，并使吸光度在0.05～1.0范围为宜第18页，课件共27页，创作于2023年2月待测血清蛋白含量=A待测A标准×C标准×500V标准V待测×（g/L）注：V标准为标准管加入标准蛋白质的体积

V待测为待测管加入的待测血清的体积

选一管与待测管吸光度相近的作为标准管，根据公式计算：标准管对照法第19页，课件共27页，创作于2023年2月标准管待测管实验结果第20页，课件共27页，创作于2023年2月管号1234567OD660nm00.1210.2500.3350.4400.5250.320MXAXM7（μg）×5001000C血清=149（μg）=74.5（g/L）第21页，课件共27页，创作于2023年2月管号1234567OD660nm00.1210.2500.3350.4400.5250.320C血清=?人血清中蛋白质的正常范围为60-80g/L0.3200.335×0.250.61A待测A标准×C标准×500V标准V待测×=71.6g/L第22页，课件共27页，创作于2023年2月

标准曲线法比标准管法精确，可消除各种原因引起的偏离吸收定律而造成的误差，但是制作比较费时。

临床应用：可用于成批样品的测定，简便省时第23页，课件共27页，创作于2023年2月血清总蛋白含量关系到血液与组织间水分的分布情况，在机体脱水的情况下，血清总蛋白质含量升高，而在机体发生水肿时，血清蛋白含量下降，所以测定血清蛋白质含量具有临床意义。

临床意义：第24页，课件共27页，创作于2023年2月思考题什么叫标准曲线？绘