1-DNA重组技术的基本工具-课件

1-DNA重组技术的基本工具基因工程的概念DNA重组技术基因DNA分子水平剪切→拼接→导入→表达2

自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？噬菌体侵染细菌的实验。思考：3基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路基础理论

艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。4基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路基础理论

沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。5基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路基础理论梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制6基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路基础理论克里克等提出中心法则DNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制7科技探索之路基础理论1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。基础理论和技术发展催生了基因工程8大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流9科技探索之路1)1967年基因转移载体的发现2)1970年工具酶的发现3)1977年DNA合成和测序技术的发明4)1972年DNA体外重组的实现5)1973年重组DNA表达实验的成功6)1980年第一例转基因动物问世7)1988年PCR技术的发明基础理论和技术发展催生了基因工程10第一节

DNA重组技术的基本工具一.准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）

——限制性核酸内切酶二.DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）

——DNA连接酶三.基因转移工具（“分子运输车”）

——基因进入受体细胞的载体11⒈主要来源：主要从原核生物中分离纯化思考一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。12⒉种类与命名：

现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶(限制酶)。

练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）SmaⅠ大肠杆菌（EscherichiacoliR）EcoRⅠ133.作用特点（1）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列例如：大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序列，一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”（2）在特定的位点切割DNA分子。并在G和A之间切开。——特异性14限制酶的识别序列：

能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成15切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。16产生黏性末端或平末端一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”4.作用结果：EcoRⅠ限制酶

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。17SmaⅠ平末端平末端一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”被限制酶切开的DNA两条单链的切口是平整的，这样的切口叫平末端。18⒈主要来源：⒉种类与命名：⒊作用特点（特异性）4.限制酶识别序列5.作用结果：识别特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)19……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合如何将不同种来源的DNA片段连接起来？生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切201.作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来。2.作用原理：催化磷酸二酯键形成二、DNA连接酶——“分子缝合针”213.种类：（1）E·coliDNA连接酶（2）T4DNA连接酶两种酶的区别：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别二、DNA连接酶——“分子缝合针”22

可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键23

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶24DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?形成磷酸二酯键以一条DNA链为模板，将单个核苷酸连接成一条互补的DNA链将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板需要不需要单个脱氧核苷酸DNA分子片段25⒈运载体必备的条件：

⑴在受体细胞中能自我复制并稳定保存

⑵有1个至多个限制酶切割位点

⑶有特殊的标记基因，便于鉴定和选择

⑷对受体细胞的生存无决定性作用⒉常用运载体：

⑴质粒

⑵λ噬菌体的衍生物

⑶动植物病毒三、基因进入受体细胞的载体——

“分子运输车”26常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别

常存在于原核细胞中，是一种裸露的、结构简单、独立于拟核之外能自我复制的很小的双链环状DNA分子。27282748361529思考与探究P7（2）2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？

通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。303、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？不能，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：思考与探究P7311）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或可整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3