免疫学技术-荧光免疫技术（临床免疫检验课件）

时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，且无放射性污染，是继放射免疫分析之后标记免疫分析发展的一个新的里程碑，被称之为“零本底”的检测方法，可用于生物样品中微量、超微量物质的检测，近年来，已将这项技术应用于核酸探针分析、细胞活性分析、生物大分子分析，将TRFIA技术与激光等技术联用，扩大了TRFIA的应用领域前言时间分辨荧光免疫测定用镧系元素如铕（Eu3+）标记抗原或抗体，并与时间分辨技术相结合而建立的一种新型超微量物质免疫分析方法基本原理AgEu3＋/AbEu3＋+Ag/Ab检测AgEu3＋-Ab/AbEu3＋-Ag?Ab/Ag方法类型双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法123双抗体夹心法Eu增强液Eu固相Ab待检Ag每一步均需洗涤Eu解离发光Eu标记Ab激发固相抗体竞争法增强液激发固相AbAg？AgEu3+荧光强度与待检抗原含量成负相关固相抗原竞争法增强液激发AbEu3+Ag？固相Ag荧光强度与待检抗原含量成负相关方法评价特异性强，灵敏度高分析范围宽标记物稳定测量快速，易自动化易受环境、试剂和容器中的镧系元素离子污染使本底增高方法评价优点缺点临床应用药物肿瘤标记物病毒抗原用于微量或超微量物质检测激素蛋白质酶010203时间分辨荧光免疫测定的方法类型时间分辨荧光免疫测定的临床应用

小结时间分辨荧光免疫测定的检测原理思考题时间分辨荧光免疫测定的基本原理是什么？包括哪些技术类型？该技术的优点是什么？荧光免疫技术基本知识荧光免疫技术最早由Coons等于1941年建立，当时是用异氰酸荧光素(FIC)标记抗体，检测小鼠组织切片中可溶性肺炎链球菌多糖体。1958年Rigg等合成了异硫氰酸荧光素(FITC)，因与抗体的结合十分稳定，性能远较FIC优良而使此技术迅速推广。同年，罗达明B200和异硫氰酸四甲基罗达明相继被合成，使对比荧光染色和双标记荧光技术得以实现。此技术早年又称荧光抗体技术，主要用于未知抗原或抗体的定性检查。前言基本知识荧光免疫技术用荧光素标记Ab或Ag，与待测标本Ag或Ab结合通过检测荧光，确定标本中有无相应的Ab或AgAbF（AgF）+Ag（Ab）AbF-Ag/（AgF–Ab）激发光荧光检测荧光免疫技术基本知识荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态当其回复至基态时，发射出的波长大于激发光波长的光基态发射光（荧光）基态（荧光物质）激发态发射光谱激发光谱激发光荧光基本知识指固定激发波长在不同波长下记录到的样品所发射的荧光强度发射光谱指固定检测发射波长用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度激发光谱基本知识荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的时间荧光物质在某些理化因素作用下发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭荧光效率荧光寿命荧光淬灭基本知识荧光物质从激发态回到基态的过程中，由于部分能量丢失而导致发射光波长比激发光波长长两者波长之差Stokes位移荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能并发出单一平面的偏振荧光的现象荧光偏振基本知识荧光素最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490nm～495nm520nm～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定流式细胞术四乙基罗丹明(RB200)570nm595nm～600nm（橘红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT也可单独采用藻红蛋白（PE）490nm～560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术碘化丙啶（PI）488nm620nm（橙红色）DNA染色Eu3+螯合物300～350nm603～623nm时间分辨荧光免疫测定荧光抗体制备123荧光素与蛋白质的标记荧光素标记抗体的鉴定与保存荧光素标记结合物纯化010203常用的荧光素荧光抗体的制备

小结荧光相关基础知识思考题ABA常用的荧光素有哪些？主要应用在哪些方面？荧光免疫显微技术荧光抗体技术是用荧光素标记的抗体或抗原检测未知的抗原或抗体，荧光免疫显微技术是经典的荧光抗体技术，阳性样本片在荧光显微镜下，荧光素受紫外光或蓝紫光的照射而发出荧光。荧光可通过荧光显微镜、荧光分光光度计或流式细胞分析仪检测前言基本概念将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和形态学直观性相结合的标记免疫技术荧光免疫显微技术基本原理

AbF+Ag（组织/细胞）AbF-Ag检测特异性荧光紫外线方法类型直接法间接法双标记法123直接法固定Ag（待测）＋Ab*——AgAb*Ag？

AbF用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合洗涤、干燥后在荧光显微镜下观察特异性荧光，以检测未知抗原间接法单击此处添加标题单击此处添加标题AgAb抗－Ab*间接法用特异性抗体与标本中相应抗原反应后，再用荧光素标记的第二抗体(抗抗体)与抗原抗体复合物中第一抗体结合，洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光，以检测未知抗原或抗体双标记法ThCD3（FITC黄绿）（RB200橘红）采用两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体，对同一标本进行荧光染色，洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光，若有两种对应的抗原存在，可显示两种颜色的荧光关键技术单击此处添加标题0102荧光显微镜检查标本制作荧光抗体染色荧光抗体染色结果判读0304标本制作组织切片冷冻切片、石蜡切片印片肝、脾、淋巴结等器官或组织涂片各种体液、穿刺液、细菌和细胞悬液培养细胞

单层培养细胞组织切片印片涂片培养细胞荧光抗体染色单击此处添加标题单击此处添加标题单击此处添加标题在已固定的标本上滴加适当稀释的荧光抗体置湿盒内25℃～37℃温育30分钟，不耐热抗原检测以4℃过夜为宜温育后充分洗涤，待干燥后镜检荧光抗体染色直接法间接法荧光显微镜检查光源滤光片光路聚光器镜头高压汞灯、氙灯或卤素灯隔热滤光片、激发滤光片和吸收滤光片透射光和落射光明视野、暗视野和相差聚光器消色差镜头光路图透射荧光光路(a)落射荧光光路(b)结果判断“-”：无或极微弱“+”：较弱但清晰可见“++”：明亮

“+++”：耀眼阳性：特异荧光强度“+”以上效价：呈"+"的血清最高稀释度设立实验对照阳性对照和阴性对照区分特异和非特异染色阳性细胞显色分布胞质型、胞核型膜表面型方法评价可用于抗原或抗体的定位、定性检查，既有抗原抗体反应的高度特异性，又能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强优点荧光容易消退，难以制备永久性标本，非特异荧光常干扰结果判