miRNA对茶叶风味与香气形成机理

茶叶风味与香气形成机理综述金立成金日光RNA和DNA究竟如何形成的？这就有必要进一步从最原始的，起源来加以阐明原始RNA和DNA之间定量关系。众所周知，世界人类基因科学界为测定人类DNA基因组密码子测序作了大量的研究，最终通过蛋白质的测序确认人类DNA中能够“编辑”出蛋白的有效基因数为3万多个，比起线虫多出2万个，比果蝇多1万个；故有人说人类基因没啥优越性！但是作者发现人类基因有至高无上的二个特色：一是，在人类基因组中充满着富含C+G,T+A(G)，C+A的密码子链段;越高级的生物越富含C+G密码子;。二是，人类基因有长链的DNA之前，先有RNA,后有DNA，并分别进入46个染色体中,使染色体的数量的增殖方式极为特殊。生物初始生态基因RNA,后形成DNA的过程。当代基因科学界到目前为止不知道为何先有人类初生态第-批RNA,而后才形成DNA的?同样也不知道和它所对应的第一批蛋白体是如何形成的。作者对此在前几文中有过讨论，但是看来还有必要进一步探讨这个问题，其中最重要的是在地球上先形成“生命的化学汤”。在远古，地球，上开始没有生命的物质，是无机世界，但在生命的化学演化过程中靠自然界，光，电，热，尤其在生命动力源的一系列含水络合离子群(Na,R,Ca,Mg,Sr，Sc,T,V,Cr,Mn,Fe，Co，N,Cu,Zn,......的催化、激活动力作用下，在“生命的化学汤”里形成了足够的腺嘌呤(A),乌嘌呤(G),胸腺嘧啶(T)，或尿嘧啶(U)及胞嘧啶(C)的聚磷酸核甘(脱氧)单体及二十种氨基酸。不过这只是基本的生命物质的原料而已，当代生命科学和基因科学，如果不用上述五种碱基的内聚能(密度)大小概念，那么可以说人类永远不可能知道人类自己身上的DNA，RNA是究竟如何来的!当下最幸运的是我们有了五种碱基内聚能计算的方法及其、有关的数据。通常DNA中的碱基为T、A、C.G,而在RNA中的碱基为U、A.C、G。但严格地来说，由于∪,T的氢键能力，每原子的净电荷几乎相同，两种碱基的基态的π键级都十分接近，故在DNA及RNA中T和U可以共存，且在转录过程中保证T-→U,故在通常讨论中不再严格区分T或U。不过在DNA中T比U多，而在RNA中T很少1以上五种碱基的内聚能密度的数据为我们人类了解自身的DNA，RNA是如何来的，提供了最重要的信息，通过大量的研究，五种碱基的内聚能密度起到下列三大功能:。1.1内聚能密度的第-大功能:定量地说明了基因密码子可简并的根本原因。首次知道了反密码子三联体中心碱基的内聚能大小决定了64种密码子对20种氨基酸的简并性:二十种氨基酸，按其内聚能密度的大小，分别对应到具有同--大小内聚能密度的碱基上，可以圆满地解释了本文开头讲的当代基因科学遇到的最大难点之一,就是为什么二十种氨基酸分别同上述五种碱基有密切匹配的根本原因!。1.1.1以腺嘌呤(A)为中心碱基(Y)的聚磷酸酯氨基酸三联核苷酸盐vmiRNAs植物与环境相互作用miRNAs是植物发育过程中的关键调控因子。miRNAs在植物发育中的作用已经有了很好的综述。在本文中，研究者总结了miRNAs在表型可塑性、非生物/生物响应以及共生/寄生互作中的功能。MicroRNA在发育可塑性中的生物学功能miRNA不仅充当植物发育过程中的主要调节剂，而且还参与调节各种环境刺激（例如光，温度和营养素）引发的表型可塑性。光：miR156是进化过程中最保守的miRNA，其靶向SPL基因的一个子集。除了在植物发育的阶段过渡中发挥作用外，miR156-SPLs模块还发挥着避荫综合症的负调控作用，这是植物避免被遮荫或与相邻植物争夺阳光的自适应策略。在拟南芥中，荫蔽可以激活PHYTOCHROMEINTERACTINGFACTORs（其直接与MIR156s结合并转录抑制MIR156s的表达），从而导致SPLs基因的上调。SPLs蛋白介导各种形态学上的变化，这些变化与避荫综合症响应的增强有关。在拟南芥中进行UV-B辐射后，miR396可以被诱导表达从而抑制其靶标GROWTHREGULATINGFACTORs(GRFs)。通过靶向GRFs，miR396介导了叶片生长的抑制，这是植物阻止细胞周期的一种自适应策略，从而有时间修复UV-B造成的DNA损伤。在水稻中，miR2118靶向长的非编码RNA（PHOTOPERIOD-SENSITIVEGENICMALESTERILITY1TRANSCRIPT

(PMS1T)），并在长期诱发phasiRNAs的产生，导致对光周期敏感的雄性植株不育。在农垦58S品系中，编码PMS1T基因座的单核苷酸多态性可能介导miR2118对PMS1T基因的识别，以及对光周期敏感的雄性不育，这是一种很有价值的种质资源，最初用于水稻的两系杂交育种。温度：在拟南芥中，miR156和miR172具有温度响应性，在暴露于低温环境后能够协调好开花的时间。这是植物响应温度波动时具有的最引人注目的热适应策略之一。miR156和miR172已经被用于定义正常生长条件下，众所周知的年龄依赖型开花途径。随植物年龄变化，miR156的水平下降会导致SPLs基因的上调，从而通过直接激活关键开花基因（如LEAFY、FRUITFULL和SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCO1）的表达来加速开花过程。SPLs还通过miR172-介导的AP2阻遏来诱导开花诱导剂FLOWERINGLOCUS（FT），从而直接激活MIR172以促进开花。为了响应较低的环境温度，miR156被上调并且主要用来抑制SPL3。SPL3的抑制导致FT和FRUITFULL的下调以及开花时间的延迟。miR172的下调与miR156的上调同时发生。

miR172的下调又反过来激活AP2以抑制FT，从而产生对开花调控的适应性抑制。miR172的下调主要是由FCA积累的减少引起的，而FCA是一种可以与pri-miR172结合并促进pri-miR172加工的RNA结合蛋白。硝酸盐和铝：在响应各种环境刺激时，几种miRNA调节模块在根系生长结构（RSA）的修饰中起着重要作用。RSA的许多发育可塑性是通过miRNA-介导的生长素信号传导调节来实现的。保守的miR167通过靶向AUXINRESPONSEFACTOR8

(ARF8)负调节生长素信号的传导。拟南芥在较高的硝酸盐条件下，miR167的水平下降，使ARF8在中柱鞘和侧根冠中积累，从而增强了生长素信号传导，进一步促进了侧根的萌生，但抑制根的伸长。这个过程代表了植物采取的一种策略，用来调整其对营养成分作出的发育响应（图2）。与增加的生长素信号传导一致，拟南芥中在早期硝酸盐响应期间就诱导了生长素受体AUXINSIGNALINGF-BOX3（AFB3）基因。但是，在硝酸盐还原和同化过程中形成的某些代谢产物可以诱导miR393的表达从而抑制AFB3表达。因此，AFB3-介导的植物生长素信号转导的增加和响应硝酸盐变化而进行的RSA修饰是短暂的。与拟南芥硝酸盐代谢过程中的miR393诱导相反，大麦在毒性铝的胁迫下miR393被下调。miR393靶向生长素受体TRANSPORTINHIBITORRESPONSE1（HvTIR1）和HvAFB产生的抑制作用减缓能够增强生长素信号传导，并有助于通过铝胁迫来抑制根的伸长（图2）。通过调节RSA的发育可塑性，miRNA-介导的环境刺激和植物激素信号传导（例如生长素信号传导）的整合可促进植物适应动态变化的环境（图2）。miR160、miR167、miR390和miR393等miRNAs通过靶向生长素途径的基因来响应环境刺激，并微调生长素信号的传导，从而赋予植物热/冷耐受性、抗菌感染、共生结节/丛枝的形成、寄生虫胆的形成和根系的可塑性。TIR1/AFB编码一种植物生长素受体；IAR3编码吲哚-3-乙酸–丙氨酸水解酶，该酶能够从非活性储存形式释放具有生物活性的生长素。flg22（来源于真细菌鞭毛蛋白的22个氨基酸肽段）可以被宿主植物感知并触发基础免疫。AM真菌通过形成丛枝与宿主植物产生共生互作。RKN通过形成“胆”觅食结构而与宿主植物产生寄生互作。图2.

整合了环境刺激和生长素途径的miRNA模块。MicroRNA在非生物胁迫响应中的生物学功能植物由于固定位置生长而持续处于不利条件下，例如极端温度、高盐、干旱和营养缺乏。这些非生物胁迫是限制植物地理分布和产量的主要因素。为了减少这些非生物胁迫的不利影响，植物已经进化出特定的机制，使其能够耐受胁迫条件并且生存下去。miRNA-介导的基因表达调控是植物应对非生物胁迫的重要机制。冷和热：植物对热胁迫的响应包含诱导HSPs蛋白以保护细胞内蛋白质不变性。植物也可以进行热应激启动，其中植物回归到适合环境后能够获得更高的胁迫耐受性。多种miRNAs参与这些热响应。拟南芥的miR398参与了基本的耐热反应。两种热激转录因子能够诱导MIR398基因的表达，而miR398依次抑制其靶基因COPPER/ZINCSUPEROXIDEDISMUTASE1(CSD1)、CSD2和COPPERCHAPERONEOFCSD，其抑制作用通过增加热激转录因子和HSPs蛋白的表达来提高耐热性。与野生型植物相比，表达抗miR398的CSD1、CSD2和CSDCOPPERCHAPERONE转基因植物对热更敏感，并且展现出热激转录因子的急剧减少。在棉花（陆地棉）中，miR160通过靶向ARF10/16/17来介导生长素信号传导的抑制作用，从而导致棉花在高温胁迫下的花药育性（图2）。然而miR160在耐热棉中被下调，但其过表达会增加植物的热敏感性。miR156-SPLs模块可能有助于植物的热应激启动。在拟南芥中，反复出现的热应激诱导了miR156，其作用是保持热应激记忆。在这个过程中，SPLs可能充当转录阻遏物，从而抑制参与热应激记忆过程的某些基因。由miRNAs介导的另一种适应策略是在耐热农作物向日葵中发现的，这种向日葵进化出特殊的miR396-HaWRKY6调控模块，该模块可能在植物生长发育过程中起到高温保护作用。实际上，表达抗miR396的HaWRKY6转基因植物出现耐热性受损的现象。在植物中，冷胁迫能够诱导出一套不同的响应。在甘蔗和水稻中，冷胁迫诱导了在进化上十分保守的miR319表达。miR319的过表达下调了TEOSINTEBRANCHED1、CYCLOIDEA,PROLIFERATINGCELLNUCLEARANTIGENBINDINGFACTOR这两个基因并增强两个物种的耐冷性，这表明miR319可以作为耐冷性的正向调节剂。通过靶向生长素受体基因TIR1/AFB，冷诱导的miR393也可以正调控柳枝稷草的耐冷性（图2）。miR393过表达或TIR1/AFB突变会增强植物耐寒性，并伴随着冷应答基因表达的增加。干旱：为了适应干旱条件，植物通过抑制初生根的生长并增加侧根的发育来最大程度地吸收水分，从而修饰其RSA。作为众所周知的侧根形成的形态发生诱因，具有生物活性的生长素吲哚-3-乙酸（IAA）的积累有助于RSA的塑性变化。在拟南芥中，miR167a被下调，其靶向IAA-ALARESISTANT3基因（编码IAA-Ala水解酶，从非活性储存形式的生长素中释放IAA），该基因被抑制从而促进IAA积累和侧根发育（图2）。miR165/166通过靶向编码HD-ZIPIII转录本的方式，成为植物生长和发育过程中重要的调节剂。这些miRNA还负调控植物的干旱耐受性。miR165/166的下调赋予拟南芥和水稻抗旱性的增强，这可能是HD-ZIPIII-介导的ABA水平升高的结果。在拟南芥中，干旱也能下调miR169的表达，从而诱导NUCLEARTRANSCRIPTIONFACTORYSUBUNITALPHA5（NFYA5）的产生。NFYA5的过表达增强了植物抗旱性，而nfya5突变株和miR169过表达的植物对干旱表现出高度敏感性，这表明NFYA5赋予了植物抗旱性。NFYA5可能通过介导胁迫应答转录级联反应来实现该功能。大豆的miR169-GmNFYA3模块也具有耐旱性，这表明miR169-NFYA模块在植物抗旱性中的调控作用是保守的。除了下调miR169之外，植物还进化出其它机制来确保干旱条件时能够诱导NFYA5。在拟南芥中，NFYA5的反义基因ENHANCINGRINGFINGER(NERF)可以产生与miR169具有类似序列但不能指导NFYA5

mRNA切割的siRNA。通过与miR169的竞争，NERF

siRNA可以防止miR169-介导的NFYA5表达抑制。这种机制有助于NFYA5-介导的干旱耐受性，这种现象可以通过NFYA5的高积累和NERF过表达品系中干旱耐受性增强以及NERF敲除品系中表型相反来证明。最近，杜等人证明了拟南芥中的脱水休克反应诱导了miR169i和miR1691并通过翻译激活的方式正调控NFYA5基因的表达。营养不足：为了在各种条件下成功生长，植物必须能够克服营养缺乏症；此外，为了以最少的营养吸收获得高产量，农作物必须有效地利用养分。在低营养条件下，一小部分miRNA被鉴定是介导营养稳态转录后调控的主要调控因子。这些miRNA的鉴定拓宽了研究者对营养饥饿反应分子机制的理解，同时可以为作物营养利用效率的提高提供相关信息。一些miRNA调节模块会影响一般养分的吸收。最近研究发现，miR166靶向RICEDOFDAILYFLUCTUATIONS1

(RDD1)，其编码Dof转录因子。

miR166-介导的调节导致RDD1昼夜摆动的表达模式。在低营养条件下，抗miR166

RDD1的过表达显着增加了营养离子（NH4+，PO43-和K+）的吸收和积累，这表明miR166-RDD1操纵子可以应用于水稻育种中，从而提高营养的利用效率。相反，其它模块会影响特定的营养素。miRNA-介导的调节影响大量营养素（如磷酸盐、氮和硫）以及微量营养素（如铜）的摄取。磷酸盐：磷（Pi）是所有活体生物中大分子生物合成、能量转移、酶活和信号转导必不可少的重要营养素。此外，磷的水平经常限制农作物的产量。拟南芥中发现的第一个参与Pi-饥饿反应的miRNA是miR399。在Pi充足的条件下，假定的泛素结合酶PHO2将多泛素添加到Pi转运蛋白PHOSPHATETRANSPORTER1（PHT1）上，并靶向PHT1从而进行降解，以保持最佳的Pi吸收率。低浓度的磷胁迫强烈诱导拟南芥和水稻中的miR399从而下调PHO2。miR399对PHO2的下调会增加PHT1的水平，从而增加Pi的吸收和转运。在正常条件下，miR399的过表达会导致植物芽中Pi的过度积累并呈现出Pi中毒的症状，这种现象类似于拟南芥和水稻中PHO2基因的突变。在植物遇到Pi不足的条件时，miR399在表达PHO2的血管组织中积累，并且通过相互嫁接实验能够表明miR399可以从嫩芽转移到根部。这表明miR399在低Pi条件下能够作为系统信号来调节Pi的吸收和转运。在早期Pi饥饿响应中miR399的转移至关重要，因为与拟南芥新芽中MIR399的表达相比，其在根部的早期表达很低。随着Pi饥饿响应的进行，miR399在根和芽中积累的增加会导致植物对Pi的过度吸收；负调节剂可能起到拮抗miR399-介导的Pi收集和转运的作用。IPS1就是一种这样的负调节剂，它是一种非编码RNA，具有与miR399互补的序列。在拟南芥中，Pi缺乏时可以诱导IPS1的表达。由于miR399-IPS1碱基互补配对区域中有一个凸起，IPS1被隔离，而不是被miR399切割。IPS1敲除植株在嫩芽中积累过量的Pi，这表明在Pi饥饿响应期间IPS1对维持Pi稳态具有关键调节作用。几种植物中的Pi缺失也会强烈地诱导进化上保守的miR827。在拟南芥中，miR827靶向NITROGENLIMITATIONADAPTATION

(NLA)（编码泛素E3连接酶）。与miR399-PHO2模块功能相似，miR827-NLA模块也调节Pi转运蛋白PHT1的泛素化，从而在Pi饥饿响应期间平衡Pi的吸收和转运。值得注意的是，与拟南芥中的miR827-NLA模块相反，水稻中miR827并不靶向NLA的同源物，而是靶向PHT5家族的两个成员（充当液泡Pi转运蛋白），以介导Pi在水稻和拟南芥中的存储或迁移。最近，基于靶标预测分析，Lin等人发现miR827在大多数被子植物中保守地靶向PHT5的同源物，但在十字花科和豆科植物中优先靶向NLA的同源物，这表明在进化过程中miR827的靶标已经从PHT5转移到NLA。这种新的miRNA-靶标模块采用了不同的调节机制，但仍参与到与其原始模块相同的生物学过程中，这表明miR827对调节细胞内Pi稳态的重要性。氮和硫：氮是限制植物生长和作物产量的另一个因素。硝酸盐缺乏会诱导多种植物中miRNA表达的变化。当硝酸盐缺乏时，拟南芥表现出miR169a的下调同时上调其靶标蛋白——NFYA家族成员。miR169-NFYA模块可能调控硝酸盐吸收系统的适应性响应，这从以下现象中可以看出：miR169的过表达减少了多种硝酸盐转运蛋白基因的表达并且能够引起早期衰老的表型。小麦中也发现了miR169-NFYA响应硝酸盐饥饿时具有相同的调节作用，同时该模块还显示出对低浓度可利用磷的响应。在不同水平的养分供应田间试验中，TaNFYAB1的过表达显着增加了硝酸盐和磷酸盐的吸收以及谷物的产量，这表明miR169-NFYA模块在以较少肥料投入为目标的高产育种中具有巨大潜力。实际上，基于对硝酸盐和磷酸盐不足时具有相似的响应，可以把更多的miRNA模块（包括miR827-NLA和miR444-ANR1）作为提高植物养分利用率的工程目标。可利用的硫还能调节植物的生长，活力和农作物产量。当硫缺乏时，拟南芥和水稻均强烈地诱导miR395去靶向ATP硫酸化酶和SULFATETRANSPORTER2；这两者都是硫酸盐代谢途径的关键因素，并且能够介导硫酸盐的同化和吸收或转运。在拟南芥和水稻中过量表达miR395的植物均表现出S饥饿症状，这进一步证明miR395充当了植物硫响应和代谢的负调节剂。由此可以提出了一个问题，即为什么当硫缺乏时会诱导出负调节剂。由于SULFURLIMITATION1（硫酸盐转运蛋白和ATP硫酸化酶的转录激活因子）介导miR395的转录激活，而miR395可能被诱导以维持硫酸盐转运蛋白和ATP硫酸化酶的最佳水平，从而在低硫条件下实现硫稳态。拟南芥在缺硫条件时，氧化还原信号也可以诱导miR395的表达，这表明在响应硫缺乏时，miR395的表达时一个复杂的调节过程。铜：铜是植物必需的微量营养素。它在光合作用和呼吸作用的电子运输中ROS的清除、细胞壁代谢和乙烯感知中起着重要作用。植物已经进化出一组miRNAs去下调可分配的含铜蛋白质以应对铜缺乏的情况，从而节省铜用于必需的生物过程（例如光合作用）。铜响应性miRNA包括miR397、miR398、miR408和miR857。当响应铜缺乏条件时，所有这些miRNA均被转录因子SPL7诱导转录，该转录因子是一个保守的铜感应因子，就像其绿藻同源物COPPERRESPONSEREGULATOR1。miR398的诱导导致CSD1和CSD2的下调，它们是拟南芥中ROS清除和氧化应激耐受性过程中重要的含铜蛋白。miR397、miR408和miR857下调了可分配的含铜蛋白质plantacyanin和漆酶。与单细胞绿藻相比，当铜不足时高等植物缺乏COPPERRESPONSEREGULATOR1-介导的铁依赖性细胞色素c6途径从而用于光合作用，且高等植物对铜的需求更大。高等植物中进化的SPL7-miRNA含铜蛋白质模块可能代表了一种适应性调控级联反应，以满足铜缺乏条件下光合作用的铜需求。因此，miR408的过表达可以增强各种高等植物的光合作用、生长和产种量。MicroRNA在生物胁迫响应中的生物学功能在自然界中，植物不断受到病原体的攻击，其中包括真菌、细菌、病毒和昆虫。miRNA是介导植物对生物胁迫免疫响应的重要参与者。到目前为止，至少有21种miRNA-靶标模块参与到植物对病原体的防御过程。许多miRNA途径的突变体，例如dcl1、hen1和ago1，出现了对细菌或病毒抵抗力下降的现象。抗细菌和抗真菌免疫力：受到细菌和真菌的攻击后，宿主植物可以识别保守的相关病原体的分子模式（PAMPs），并激活基础防御PAMP-触发的免疫（PTI）。在拟南芥中，miR393被PAMP鞭毛蛋白（flg22）诱导转录，从而下调F-box生长素受体TIR1，AFB2和AFB3的水平；抑制植物的生长素信号；且有益于植物防御致命的细菌性病原体Pseudomonassyringaepv.tomato

DC3000（图2）。miR160a被诱导并且通过靶向ARFs、增加胼胝质的沉积从而帮助PTI。在水稻中，miR398b被诱导防御稻瘟病菌Magnaportheoryzae，从而帮助PTI。水稻亚种特异性的miR7695靶向NATURALRESISTANCE-ASSOCIATEDMACROPHAGEPROTEIN6的可变剪接转录本，从而赋予植物对M.oryzae的抗性。在大豆根中，当类似真菌的病原体Phytophthorasojae侵袭时miR393和miR166被诱导并参与到PTI过程。尽管许多miRNA被诱导去抑制植物防御的负调控因子，但有些miRNAs也会被下调以帮助植物抵抗病原体。在拟南芥中，miR398b和miR773被flg22下调，以增加胼胝质的沉积及植物对细菌的抵抗力。当细菌和真菌感染后，miR400被下调，导致PENTATRICOPEPTIDEREPEAT1/2基因的表达增强，这两个基因均编码定位于线粒体的五肽重复序列，并且可能通过控制ROS的代谢来促进PTI。在水稻中，miR164a被下调，其靶标转录因子OsNAC60被抑制，从而增强了植物对M.oryzae的防御反应。病原体通过将效应蛋白传递到植物细胞中来对抗PTI。为了抵抗病原体的入侵，植物细胞利用R蛋白识别效应蛋白并启动具有更强触发-效应的免疫（ETI）。与结合AGO1并参与PTI的miR393不同，miR393*是由无毒性P.syringaepv.TomatoDC3000携带的效应子avrRpt2诱导的。这种miRNA优先加载到AGO2中，并通过抑制MEMB12的表达来促进抗菌性PATHOGENESIS-RELATEDPROTEIN的分泌，从而促进ETI。MEMB12是定位于\t"/content/21/0420/11/_blank"高尔基体的SOLUBLENETHYLMALEIMIDESENSITIVEFACTORATTACHMENTPROTEINRECEPTOR蛋白。类似地，miR863-3p被DC3000表达的avrRpt2诱导，并且帮助PATHOGENESIS-RELATEDPROTEIN蛋白分泌的增加，尽管其与AGO1结合并抑制ATYPICALRECEPTOR-LIKEPSEUDOKINASE1和2，但能能达到促进ETI的效果。在大麦中，miR398-CSD1模块可以促进R基因MILDEWRESISTANCELOCUSA（MLA）-介导的ETI。大麦在被大麦白粉病真菌感染后，MLA的激活可以下调miR398以抑制其靶基因CSD1的表达，从而增加CSD1-介导的ROS积累和细胞死亡。但是，R蛋白引发的ETI对植物具有适应性代价，因此在没有病原体侵袭的情况下ETI被阻止且在防御后被减弱。一组miRNA靶向R基因的转录本并触发phasiRNA的产生，从而在没有病原体感染的情况下防止R蛋白引发自身免疫（图3）。最初发现，苜蓿中具有22个核苷酸的miRNAs（miR2118、miR1507和miR2109）可以靶向并切割nucleotidebindingandleucine-richrepeat

(NB-LRR)基因（最大的一组植物R基因）的mRNA，并触发phasiRNA的产生。随后，已证明miRNA-介导的R基因表达调控是一种保守的机制。在烟草中miR6019/6020靶向TIR-NBLRRimmunereceptorN基因，在番茄中miR482/miR2118/miR5300靶向具有卷曲螺旋结构域的NB-LRRs，在大麦中miR9863靶向MLA是等位基因。当病原体感染后，病原体衍生出的效应蛋白会抑制这些miRNAs-介导的沉默级联反应，同时激活ETI。植物防御后，这些miRNAs受到抑制，R基因又被抑制以防止过度免疫（图3）。有趣的是，这些miRNA-R基因模块与年龄相关的ETI有关。番茄和烟草生长过程中R基因表达的全基因组提高与R基因相关的小RNA（sRNAs）（包括miRNA和phasiRNA）的减少有关。由于miR6019/6020的逐渐减少和NB-LRRs表达的增加，成熟植物对烟草花叶病毒的抵抗力也逐渐增强。图3.miRNA-介导的R基因调控。一组22个核苷酸的miRNAs可以靶向R基因并触发phasiRNA的产生，从而增强许多植物中R基因的沉默。（a）在没有病原体的情况下或在免疫的后期，这些miRNA-R基因模块被激活从而防止自身免疫或过度诱导的免疫，而这两种情况都对植物具有适应性代价。（b）在病原体感染后，由于病原体效应蛋白的作用，这些22-ntmiRNAs介导的沉默被抑制，从而激活R基因以引发效应蛋白-触发的免疫反应。抗病毒免疫：与细菌和真菌感染相似，病毒感染也会引起miRNAs水平或活性的改变，这通常与RNA沉默途径组分的诱导有关。当水稻条纹病毒（RSV）感染水稻时，多种miRNAs（包括miR535、miR390和miR171以及部分OsDCL和OsAGO）被诱导。miR393和选定的水稻RNA-依赖性的RNA聚合酶均被水稻矮缩病毒诱导。在另一项研究中，当RSV感染水稻，单子叶植物特异性的miR444被诱导出来，并通过靶向3种

MIKCC-型MADS盒蛋白来减缓RNA-DEPENDENTRNAPOLYMERASE1的转录抑制，从而提高抗病毒siRNAs的产量和病毒抗性。水稻AGO18是一种缺乏切割的AGO蛋白，可被RSV诱导，然后结合并隔离miR168，从而释放其靶蛋白AGO1，从而赋予植物广谱性的病毒抗性。除了影响RNA沉默途径组分的表达外，miRNA水平或活性的改变也可能会调节其它细胞过程，并有助于植物防御病毒。例如，在RSV感染后，单子叶植物特异的miR528被AGO18隔离，导致其靶标蛋白L-ASCORBATEOXIDASE的抑制被减轻。抗坏血酸氧化酶水平的升高会增加ROS的积累并增强抗病毒防御能力。抗昆虫免疫力：在拟南芥中，miR156-SPL9模块可正向调节植物对棉铃虫的抗性。幼年期高水平的miR156抑制了SPL9（miR156的靶标）。而SPL9保护茉莉酸信号通路的阻遏物JASMONATE-ZIMDOMAIN蛋白3不被降解，SPL9的抑制激活了茉莉酸信号通路并增强了植物对昆虫的防御力。在Nicotianaattenuate中，AGO8对植物抗Manducasexta幼虫十分重要，并且可能调控与miRNAs有关的M.sexta幼虫抗性。在黄瓜中，多种miRNA-靶标模块通过抑制植物生长素信号传导途径来介导对蚜虫的抗性。基因表达的跨种调控：有趣的是，植物利用miRNA途径来增强自身免疫力，并将其miRNAs输入到某些病原体中，以沉默具有重要毒性的效应因子并削弱病原体。当棉花大丽轮枝菌感染拟南芥和棉花时，miR166和miR159分别被诱导并输入到真菌菌丝中，从而分别抑制Ca2+依赖性的CYSTEINEPROTEASE-1和ISOTRICHODERMINC-15HYDROXYLASE的表达，这两种基因的大丽轮枝菌敲除株毒力减弱且无法引起枯萎病。sRNA（包括miRNAs）的输出，最近被发现是由植物胞外液泡的分泌物（可以被真菌细胞吸收）完成的。MicroRNA在共生过程中的生物学功能为了应对营养匮乏，豆科植物与土壤根瘤菌和丛枝菌根真菌建立了共生互作，分别促进了固氮根瘤和菌根丛枝的形成。固氮根瘤有益于植物，将游离的氮转化为生物学上可利用的氮，而菌根丛枝有助于植物有效吸收矿质养分。这些结构的形成包含一系列复杂的细胞重编程事件。miRNA-介导的对共生相关的基因或生长素信号传导的调节为精细调控重编程事件提供了额外的控制保障。共生相关基因：一个复杂的信号网络控制着根瘤。NODFACTOR-介导的信号传导通路促进了根瘤的形成，而AUTOREGULATIONOFNODULATION(AON)信号-介导的负反馈系统可防止根瘤耗能过多。miR169首先被确定参与了根瘤的过程。miR169靶向HAP2MtHAP2-1的紫花苜蓿同源基因，其编码共生特异性的转录因子，并在空间上将MtHAP2-1的mRNA转移至根瘤的分生组织区域。这对于根瘤细胞的分化至关重要，因为表达抗-miR169

的MtHAP2-1转基因植物出现了损害根瘤生长的现象。感染了根瘤菌后会诱导出miR172，它可正调节大豆、Lotusjaponicus和普通黄豆中的根瘤。在大豆结瘤形成过程中，miR172的诱导会抑制其靶标NODULENUMBERCONTROL1（早期结节蛋白基因ENOD40的转录阻遏物），并抑制ENOD40的表达，从而促进根瘤的形成。防止根瘤过度生长的AON信号传导可以抑制miR172表达。因此，miR172–NODULENUMBERCONTROL1调节模块代表了NOD因子与AON信号通路之间的联系，并有助于确定豆科植物中的根瘤数。防止根瘤过度形成还可以通过诱导miR171来实现。在L.

japonicus中根瘤和苜蓿中丛枝菌根的共生期间，miR171被诱导从而抑制NODULATIONSIGNALINGPATHWAY2，其编码结节形成所需的植物特异性GRAS基因家族成员。通过下调NSP2，miR171的诱导可以防止由菌根真菌引起的过度根瘤或过度定殖根。此外，通过结瘤诱导的miR393j-3p直接靶向并抑制大豆中另一个结瘤基因ENOD93，从而防止过度结瘤。与上述miRNAs的情况相反，在苜蓿中，miR396a响应菌根真菌的感染而出现表达降低。这个过程伴随着其靶标基因GRF4的表达增加。miR396的失活促进菌根真菌的根部定殖，而其过表达则会抑制这一过程，表明miR396充当着菌根丛枝形成的负调节剂。生长素信号传导：转录后的miRNA抑制生长素受体TIR1/AFB家族和多种ARF的表达。miRNA水平被精细调控以决定在结节发育的不同阶段以及在不同的结节组织中特定生长素的敏感性。在大豆中，miR160和miR167（分别靶向阻遏物ARF10/16/17和激活剂ARF8）充当生长素敏感性的正调节剂和负调节剂。在结节发育早期，低的植物生长素敏感性促进结节原基的形成。为了在此阶段实现低的植物生长素敏感性，miR167被诱导的同时，miR160的水平保持在较低水平。miR160的过表达或miR167的抑制会增加植物生长素的敏感性，从而使结节的形成明显减少。然而，在结节成熟期间，更倾向于高生长素敏感性，并且结节通过积累高水平的miR160来确保其成熟。miR393d-TIR1/AFB3模块负调节大豆根瘤的发育。miR393d在结节组织中的特异性表达决定了不同结节组织中TIR1/AFB3的表达水平和植物生长素敏感性。根据顶端分生组织的持久性，豆类结节可分为两类：确定的（例如在大豆，L.

japonicus）和不确定的（例如在紫花苜蓿、豌豆中）。两项研究表明，miRNA可能决定生长素敏感性的差异，并对不同类型结节的形成产生不同的影响。

miR390通过靶向TAS3

mRNA来调节植物生长素的敏感性，并引发次级siRNAs（即反式siRNA（tasiR）-ARFs）的产生，该次级siRNA可以裂解ARF2/3/4的mRNA。

miR390-TAS3-ARFs模块的基因损坏增加了生长素的敏感性，促进了紫花苜蓿的根瘤菌感染和结瘤。然而，由于REL3（tasiR-ARF生物形成中涉及的关键成分）的损耗，L.

japonicus中tasiR-ARF的产生被中断会导致植物生长素转运的敏感性增加，但降低植物生长素的敏感性并抑制结节。菌根丛枝的形成可能需要高的生长素敏感性。在番茄、苜蓿和水稻的菌根形成期间，miR393被下调，其靶标编码TIR1/AFB生长素受体的基因被上调（图2），而miR393的过表达会导致菌根丛枝不发育。MicroRNA在寄生过程中的生物学功能要建立寄生作用，寄生植物或蠕虫会形成特殊的进食器官从寄主植物中汲取养分。多种miRNAs参与到该过程中。在拟南芥中，miR827和miR396有助于合胞体（是由寄生性囊肿线虫诱导产生的进食结构）的形成。在合胞体初始诱导和发育过程中，miR827被剧烈上调，通过抑制其靶标NLA基因（编码在激活免疫系统中起作用的泛素E3连接酶）来抑制宿主植物的基础防御。同时，miR396被下调以抑制其靶标基因GRF1/3的表达，该靶基因编码合胞体基因表达和合胞体形成的正向调节剂。在拟南芥中，miR390和miR159促进瘿瘤的形成，瘿瘤是根结线虫与植物之间寄生互作的另一种进食器官。在瘿瘤形成过程中，高水平的miR390积累，引发了TAS3-衍生物tasiRNAs的产生，从而使ARF3沉默，导致生长素信号转导受阻（图2）。在TAS3突变体中TAS3-衍生物tasiRNAs的下调显着减少了瘿瘤的形成数量，这表明miR390-TAS3-ARF3模块对于瘿瘤形成至关重要。miR159在瘿瘤发育过程中逐渐积累，并限制了其靶标基因MYB33的表达。敲除miR159abc的突变株对根结线虫的敏感性较低，表明miR159促进瘿瘤的发育。宿主miRNAs不仅用于建立寄生，而且宿主植物也从寄生植物中接收miRNAs从而促进寄生性。寄生植物Cuscutacampestris传递一系列22-ntmiRNAs来寄生拟南芥，引发吸器（植物与植物之间寄生互作的觅食结构）中次级siRNA的产生。许多靶标与植物的发病机理有关，表明这些C.

campestris

miRNA可能作为致病因子来重塑宿主的基因表达并促进这种寄生相互作用的建立。评论MicroRNA（miRNA）是一类内源性小非编码RNA，会对基因表达产生负调控。它们是通过多个步骤产生的，包括转录、前体加工、甲基化以及miRNA诱导的沉默复合物（miRISC）的组装。本文作者回顾并讨论对植物miRNA生物形成和调控作用、miRNAs在植物发育可塑性的作用、非生物/生物响应以及共生/寄生互作中调控作用的理解，同时根据目前的研究现状，提出了植物miRNA未来研究方向的建议，同时帮助植物miRNA相关研究工作者全面及时地掌握该领域的研究现状！茶与类黄酮生物合成相关的差异基因分析

将类黄酮生物合成的19个相关差异基因可视化（图6）。这19个基因包括2个C4H，2个4CL，6个CHS，2个CHI，1个F3H，1个DFR，2个F3’H，1个FLS和1个ANS基因。HBL中的所有结构DEG均显著下调，尤其是CHS（TEA018665）和ANS（TEA015762），表达量下调10倍，表明高强度蓝光全面抑制了茶树中的类黄酮代谢。图6高强度蓝光下茶树嫩枝中黄酮类化合物的合成。

4与脂质代谢相关的差异基因分析

在脂肪酸生物合成和降解途径中（图7），只有FabG（TEA003420）在HBL中上调了4.45倍，其他七个结构DEG下调。由于参与该途径的大多数结构DEG转录丰度均显著降低，说明脂肪酸合成过程在高强度蓝光下受到了抑制。图7高强度蓝光下茶树嫩枝脂肪酸合成的DEG。

5差异表达的转录因子(DETF)分析

转录因子（TF）是参与调节植物生长发育的重要调节因子，而转录因子bHLH和MYB已被证明在调节植物类黄酮积累中起重要作用。在CK和HBL之间总共鉴定的16个TF家族包含54个差异表达转录因子（DETF）（图8）。其中包括11个bHLH和8个MYB数目最多，其次是7个AP2/ERF、5个相关、5个bZIP和4个NAC。他们的表达趋势类黄酮生物合成的相关结构DEG的表达趋势一致。图8差异表达转录因子弦图。

6代谢物对不同强度蓝光响应的变化

在不同强度蓝光下的茶树嫩芽中共鉴定出48种显著变化的代谢物（SCM）。与CK相比，LBL，MBL和HBL的SCM的数目如图9A。在聚类热图中进一步展示了SCM的倍数变化（图9B）。这些SCM主要属于脂质和类脂质分子和类黄酮，以及少量的碳水化合物和碳水化合物衍生物，核苷酸和氨基酸及其衍生物。15种脂类和类脂分子可再分为脂酰基、甘油脂类、甘油磷脂类、普列诺脂类、糖脂类和类固醇及其衍生物，其中有7种在HBL下上调。有6种类黄酮含量发生显著变化。代谢物数据进一步显示了蓝光对茶树中脂质和类黄酮代谢的影响，并且随着蓝光强度的增加，这与转录组结果一致。图9CK与低强蓝光(LBL)、中强蓝光(MBL)、HBL间显著变化的代谢产物(SCM)。

7共表达网络分析

将显著变化的类黄酮和脂质与RNA-seq数据结合构建共表达网络分析（图10A）。在树状图中确定了七个模块，其中灰色模块代表未分配给特定模块的基因，红色模块显示与类黄酮和脂质的积累模式显著相关（图10B）。其中红色模块中有83个基因与11种脂质相关。根据共表达网络中的本征基因连通性（KME）值，选择红色模块中的前50个节点基因以生成共表达子网络（图10C）。参与黄酮合成的查尔酮合成酶(CsCHS,TEA018665)和参与脂肪酸降解的醇脱氢酶(CsADH,TEA029314)基因位于网络的外围。MYB家族在植物类黄酮代谢中发挥着重要作用。这说明该CsMYB成员(TEA018665)可能参与了不同蓝光强度下茶树类黄酮和脂质代谢的调节。图10共表达网络分析。A加权基因共表达网络分析(WGCNA)得到七个模块的层次聚类树。B模块-代谢物相关性分析。C与类黄酮和脂质积累相关的红色模块的共表达子网络分析。讨论

本研究对三种不同强度蓝光对茶树幼苗基因表达水平和代谢产物谱的影响。分别与白光做差异分析，分析差异表达基因及差异代谢物并对其进行GO及KEGG注释。确定参与响应途径主要为光合作用、脂质代谢和类黄酮合成的途径。加权基因共表达网络分析(WGCNA)发现CsMYB(TEA001045)是通过蓝光调节脂质和类黄酮代谢的枢纽基因。本研究通过对不同蓝光强度照射下的嫩芽进行转录组学和代谢组学分析。评估了光合作用、类黄酮合成和脂质代谢途径的多种变化，以阐明不同蓝光强度对茶树生长和次生代谢的影响。本研究结果为进一步研究蓝光对木本植物的调控作用提供了分子数据并奠定了基础。茶树风味物质次生代谢与miRNA的关系不同茶叶组织中儿茶素、咖啡因和茶氨酸含量的变化为了鉴别茶树不同组织—芽（B）、第一叶（FL）、第三叶（TL）、嫩茎（TS）、成熟叶（ML）、老叶（OL）、侧根（LR）、花（F）和种子（S）（图1）中的主要风味物质，研究者检测了儿茶素、咖啡因和茶氨酸的含量。高效液相色谱分析结果表明，儿茶素、咖啡因和茶氨酸在九种不同组织中的含量差异显著(图2)。总儿茶素在第三片叶子中积累到最高水平，没食子儿茶素型儿茶素(ECG和EGCG)是主要的儿茶素，在除侧根之外的8个组织中占总儿茶素的64-97%(分别在嫩茎和种子中最低和最高水平)，侧根仅检测到两种简单的儿茶素，儿茶素(C)和表儿茶素(EC)(图2A)。同时，咖啡因在幼芽中含量最高，随叶片老化而降低，在花中含量较少，但在侧根和种子中未检测到咖啡因(图2B)。L-茶氨酸含量在9个组织中表现出明显的差异(图2C)，并且在B、FL、TL、TS、F和LR中显著高于其他3个组织，其中LR中的含量最高(20.99毫克/克)，比种子中的含量(2.70毫克/克)高近8倍。图1.9种组织的形态特征。

芽；FL，第一叶；TL，第三叶；TS，嫩茎；ML，成熟叶；OL，老叶；LR，侧根；F，花；S，种子。

图2.不同组织中主要风味化合物水平的变化。(A)儿茶素，(B)咖啡因和(C)茶氨酸。误差线表示三次重复的标准偏差。条形上方的不同字母表示Fisher最小显著性差异，指定的不同表达水平(P<0.05)。缩写“nd”表示在该组织中没有检测到这种物质。所示数据为平均标准差(n=3)。2

不同茶组织中挥发性化合物的变化用气相色谱-质谱法测定了茶树9种不同组织中挥发性化合物的特征。新鲜组织中的挥发性化合物主要包括萜烯(香叶醇、芳樟醇、反式芳樟醇氧化物)、苯丙烷(苯甲醇、1-苯乙醇(1PE)、2苯基乙醇(2PE)、苯乙酮和水杨酸甲酯(图3和表S2)。有趣的是，这些化合物在9个组织中显示出基本相同的变化模式。例如，除了苯乙酮和苯甲醇，其他化合物在第一片叶子中的含量最高，其次是花或成熟叶子和老叶子。但9种组织中挥发性成分的组成和比例差异较大。总的来说，9种组织中挥发性成分的数量和含量在第一片叶中最多，其次是花、芽、成熟叶和老叶，而侧根和种子不含上述挥发性成分。具体来说，第一片叶中香叶醇、芳樟醇和2-苯乙醇的含量比芽高6倍以上，这是茶叶中的重要香气物质。此外，发现一些挥发物是组织特异性的，即1-苯乙醇和苯乙酮仅在花中发现。图3.芳香化合物在不同组织中的不同积累。所示数据为平均标准差(n=3)。图4.不同组织间miRNA的表达模式。不同组织中miRNA的热图。颜色梯度说明了miRNA表达值的Z分数。3

小RNA测序图谱用小RNA(sRNA)测序法研究了9种不同茶树组织中miRNA的作用。过滤sRNA测序数据后，获得了大量有效序列(长度为18-25bp)(图S1和表S3)。如表S3所示，每个样品的有效测序读数的平均数量为4.5M，并且在九个组织中独特的有效sRNA的长度分布中可以观察到类似的模式，其中24nt的RNA是最丰富的sRNA(图S1A)。为了进一步鉴定已知的miRNA和新的miRNA，研究者将有效的序列与茶基因组(舒茶早)和miRBase

21.0中已知的miRNA进行比对。根据同源性，定位于miRBase的序列被鉴定为已知的miRNA，而定位于茶基因组的序列仅被鉴定为新的miRNA。在这项研究中，总共鉴定了298个成熟的miRNA，包括209个已知的miRNA和89个新的miRNA，其中24-nt的RNA是最丰富的miRNA(图S1B)。其中，102个在所有9个组织中表达，包括81个已知的miRNA和21个新的miRNA(图S2)。成熟微小RNA的长度分布分析表明，21-nt

RNA是9种组织中最丰富的miRNA(图S1B)。4

miRNA在不同茶叶组织中的差异表达利用R(3.6.3)的Pheatmap(1.0.12)进行差异表达分析，进一步鉴定了9种茶树组织中的组织特异性miRNA。在总共272个成熟的miRNA(198个已知的miRNA和74个新的miRNA)中鉴定出差异表达模式，这些miRNA可以根据它们在9个组织中的表达特征分成10组(第1-10组)。在9个组织中表达的miRNA的数量各不相同，最高的在花中(113个，占总miRNA的41.5%)，最低的在芽和侧根中(均占总miRNA的5个，1.8%)

(图4和表S4)。第1、2和4组占茶树特异性miRNA的比例最大，分别达到60%、55.88%和61.54%。对于保守的miRNA，大多数相同的家庭成员聚集在一个群体中。例如，miR390和miR396家族的所有成员都聚集在第8组，这两个家族分别有5个和6个成员。miR8786和miR394家族的成员集中在第5组和第2组，每组分别有35和5名成员。成员数最多(12个)的miR395家族主要分布在4组和8组，每组分别有4个和8个成员。图5.验证miRNA和它们的靶之间的相互作用。(A)通过小RNA测序和定量逆转录聚合酶链反应对靶基因进行定量表达分析。(B)

5’RLM-RACE降解分析中靶切割位点的验证。5

通过降解组测序对已知和新miRNA的靶预测这些miRNA的潜在功能是利用降解组测序技术来确定它们的靶基因。降解组测序得到35065665个原始读数，呈现9875364个独特读数。经过一系列的数据过滤和比对，21363848个(占35065665个原始读数的60.93%)干净读数成功映射到茶树基因组上有45765个转录本(占55366个转录本的82.66%)。从混合降解组中共鉴定出516个miRNA靶对，包括191个miRNA的382个靶(112个保守miRNA和79个新miRNA)。根据靶位点标签的相对丰度，所有潜在切割的靶转录本被分为五类。在第0、1、2、3和4类中分别有81、1、173、174和87个靶(图S3)。大多数miRNA(172个)可能只切割几个转录目标(少于5个)，19个miRNA可能切割5个或更多不同的转录目标，83个微小miRNA被检测到只切割一个转录目标。总共有36个靶被鉴定为被miR156d切割，并且这些靶关系中的一些被5’RLM-RACE和qRT-PCR实验验证。定量聚合酶链反应结果与高通量测序结果基本一致(图5)。其中，miR167-ARF和miR396-GRF表达模式相似，其目的基因表达水平较低，但相应的miRNAs在花中表达水平最高。有趣的是，miR159-GAMYB在花中的表达并不呈负相关，而是呈正相关，如sRNA和miRNA在花中的表达。6

与风味化合物相关的MiRNA共表达网络利用R(3.6.3)的WGCNA对sRNA数据进行分析，综合研究了miRNAs在调控不同茶叶组织中主要风味物质和挥发性物质生物合成中的作用。WGCNA鉴定了12个不同的共表达模块，包含308个miRNAs(用12种不同的颜色标记)，模块大小从4个miRNAs(绿黄色模块)到118个miRNAs(绿松石模块)(图6)。基于P值的模块和化合物之间的相关性如图6所示。如蓝绿色模块与苯乙酮和1-苯乙醇的相关性分别都达到1，说明该模块中的miRNAs可能参与了花中这两种化合物的调控；灰色模块与没食子儿茶素有很高的相关性(~0.90)，表明这些miRNAs最有可能参与茶树中没食子儿茶素的生物合成。7

miRNA表达谱与风味物质的相关性分析通过结合miRNAs、高效液相色谱和气相色谱-质谱的数据，并获得40个miRNAs和13个风味化合物具有显著相关性(cor≥0.7或cor≤0.7)，确定与主要风味化合物具有最大潜在关系的miRNAs(图7)。miRNAs的表达与儿茶素和挥发性化合物有很强的相关性。例如，没食子儿茶素的含量与miR156a、miR156c和miR156q的表达显著负相关，但与miR166j、miR172b和172d的表达正相关。非尿苷儿茶素的含量与miR169、miR171和miR319家族的表达呈正相关。此外，鲜茶叶中的重要香气物质如芳樟醇、香叶醇和2-苯乙醇与miR171o、miRN71a、miRN71b、miRN71c和miRN71d的表达呈高度正相关。图6.基于DEG数据的WGCNA共表达模块。每行对应一个模块。每个模块中的基因数量显示在左侧。每一列对应一种风味化合物。行列交叉处每个单元格的颜色表示模块和物质之间的相关系数。

图7.miRNA与主要口味的相关系数。讨论本研究以茶树不同组织的特征——代谢产物和挥发性化合物为重点，研究了茶树中miRNAs及其靶标的鉴定、分类、差异表达、靶标的确定和功能相关性。1

茶树不同组织中风味物质的含量不同在本研究中，茶树发育过程中，不同组织中茶叶的风味物质差异很大。一般来说，像儿茶素和咖啡因这样的化合物主要集中在新的旺盛生长的嫩枝中，在成熟组织中含量较少。具体来说，侧根显示出非常低的儿茶素含量，仅检测到非糖化儿茶素(C和EC)，这与先前的研究结果一致。然而，侧根的茶氨酸含量远远高于其他组织(图2C)，这在多种茶树品种中是一致的。在茶叶中，挥发性化合物是影响其产品质量的重要成分，如红茶和乌龙茶。在这些产品的制造过程中或在生物和非生物因素的影响下，挥发性化合物的形成和改性已得到广泛研究。然而，对不同组织中挥发性化合物的关注较少。一般来说，新鲜茶叶含有较少的香气成分，大部分是在制茶过程中产生的。以往的研究根据不同的生物合成途径将新鲜茶叶中的香气成分分为挥发性脂肪酸衍生物、挥发性萜烯和挥发性苯丙素/苯烯类化合物，这三类挥发性物质导致了茶叶不同的气味特征。在本研究中，在茶产品的主要原料芽、第一叶、成熟叶和老叶中检测到更多的挥发性成分。其中，花蕾和第一片叶子含有较多的芳樟醇、香叶醇和苯乙醇，有花香；检测到成熟叶和老叶含有更多苯甲醇，这显示出水果味。以往的研究表明，1-苯乙醇(1PE)是茶树花中的主要芳香物质，但在茶叶中很少发现，这一发现得到了本研究的支持。同时，在花中检测到大量苯乙酮，1PE的前体。由于本研究者收集的花刚刚展开，这些苯乙酮可以推测在花发育过程中转化为1PE。同时，1PE在当归短链脱氢酶/还原酶(CsSDR)的催化下，可以形成苯乙酮。与1PE不同，2-苯乙醇(2PE)在第一片叶中含量最高。尽管它们都来源于L-苯丙氨酸，但是叶和花中2PE、苯甲醇和1PE的不同积累取决于底物的可利用性。2

miRNA在不同的茶叶组织中有不同的功能在以前的研究中，已经发现

miRNA参与植物不同组织的各种生长和发育过程。在叶片发育过程中，miRNA166通过hd-zipIII家族成员卷叶1(rld1)调节玉米叶片的极性。在茶树中，miR166a-3p被认为参与了茎外植体脱分化和再分化的调控。在本研究的数据中，miR166c、miR166h和miR166j在芽中的表达水平高于侧根，侧根可能具有与先前报道的miR166a-3p相同的功能。在与茶树品种“平阳特早茶”芽发育相关的

miRNA的研究中，发现了21个相关的

miRNA。在另一项研究中，Csn-miR319c及其靶基因CsnTCP2tea被证实与顶芽萌发有关。在本研究中，发现miR319家族在幼芽中的表达低于其他生长旺盛的组织(嫩茎和花)，表明miR319可能与茶芽的发育有关。到目前为止，与叶的研究相比，除了杜鹃红山茶的一项研究外，对茶树花器官miRNA的研究非常有限。miRNA319、miRNA160和miRNA167在幼叶和心皮中都有高表达，但在其他组织中表达较低，这与本研究的数据一致，表明这些miRNA在山茶属物种中保留了它们的功能。通过下调一组AP2域转录因子来加速开花，miR172也被证明在花的发育中起着重要的作用，这与本研究发现的MiR172家族成员在花中特异表达是一致的。在本研究中，在幼叶(RPTM=129-199)中观察到一定量的miR172b和miR172d表达，但在侧根或果实中没有；同时，miR172a、miR172c和miR172e仅在花中表达，miR172c和miR172e高表达(RPTM=5422)，表明后两者与茶树花器官的形成密切相关。MiR167也是进化上保守的miRNAs之一，与其靶基因ARF一起调节开花时间和果实发育。本研究数据还表明，这个miRNA家族在花和果实中高度表达。有趣的是，miR167e在花中几乎特异表达，花中miR167f的表达比种子中高约76倍，在该家族的其他成员中没有显著差异，推测这两个成员可能在花的发育中起重要作用。还对参与种子发育的miRNA进行了一些研究。在水稻中，发现miR156及其目的基因理想植株结构1(IPA1)与其种子的休眠有关。在本研究测序数据中，miR156b、miR156d和miR156e在种子中相对于其他八种组织高度表达，这意味着它们与茶树的种子发育有关。此外，在本研究中，miR156家族的其他四个成员在侧根中高度表达，这与在拟南芥中发现的结果相似。由于植物生长发育是一个复杂的网络，miRNA不仅与特定的组织发育有关，而且在植物发育阶段的转化中起着重要作用。研究表明，miR156、miR159、miR166、miR172和miR396与植物发育阶段的转化有关。在本研究结果中，miR166j、miR172b和miR172d的表达随着叶片的成熟而增加，随着植物的成熟而减少，这在miR156、miR159和miR396家族中没有发现。在植物中，miR396GRF基因网络是影响植物生长的重要模块，据报道，它在叶角、茎伸长、花器官生长和病原体抗性中起着重要的调节作用。在本研究中，miR396在花中的表达水平远高于其他组织，miR396a、miR396c、miR396e和miR396h在花中的表达是在芽中的80倍，miR396b和miR396d在花中的表达是在种子中的40倍。这大概和挑料的时间有关。秋天，茶树的叶子生长不旺盛，而花朵却盛开。除了一些保守的miRNA，研究者还发现了大量的特殊miRNA。具体来说，miR8786在成熟和老叶中特异表达。在miRBase数据库中，研究者只发现gra-miR8786a和gra-miR8786b(陆地棉)可能与本研究miR8786属于同一个miRNA家族，但本研究只获得了茎环序列和成熟序列，没有任何功能注释和实验分析，因此miR8786的功能尚不清楚，需要在进一步的研究中进行阐明。3

参与茶树风味物质生物合成的miRNA及其靶点在以往的研究中，已经发现许多miRNA通过调节靶基因参与茶树主要风味物质的生物合成，这些靶基因大多是转录因子。其中，miR156-SBP、miR156F3H、miR166-HD-ZIP、miR160/167-ARF、miR393-bHLH、miR396-GRF和miR529-CHI可能参与茶树儿茶素生物合成的调控。先前和当前的研究表明，非糖化儿茶素的含量与CsANR、CsDFR和CsLAR的表达水平呈正相关。根据qRT-PCR和相关性分析，研究者发现CsANRa、CsANRb和CsLARb与miR169a、miR169l和miR319h有很高的相关性。其中9个组织中未检测到miR171d和miR171p。这意味着miR169a、miR169l和miR319h可能通过调节与CsANRa、CsANRb和CsLARb相关的一些靶基因来影响非糖化儿茶素的生物合成(图S4和表S7)。关于没食子酰化儿茶素，先前的研究已经指出，在茶树中没食子酰化儿茶素的生物合成中，氯化石蜡起着重要的作用。结果表明，大多数儿茶素单体的表达与至少一种没食子酰化儿茶素相关。因此，miR166和miR172可能负调控一些影响CsSCPLs表达的靶基因，从而影响没食子儿茶素的生物合成。此外，miR156-F3H和miR828/858-MYB对已被证明在其他植物中调节类黄酮生物合成，但在本研究中未被鉴定。此外，在其他研究中报道的参与茶氨酸合成调节的miR319-MYB对在本研究中并不高度相关。此外，在本研究中，表明miRN58和miRN101与咖啡因含量高度相关，相关系数分别为0.8631和0.9049。在未来的研究中，研究者将重点关注这些miRNA靶标的功能。先前的一些研究已经研究了参与茶挥发性化合物形成的酶和基因，例如参与芳香化合物形成的β-葡萄糖苷酶；芳樟醇和橙花叔醇形成的碳源物质。但目前仅证实ERF71激活甜橙果实中参与(E)-香叶醇合成的萜合酶基因，对茶香气相关转录因子或miRNAs的研究未见报道。在本研究结果中，发现miR171o和miRN71家族的四个成员可能参与了茶树中重要挥发性化合物的合成调节(相关系数>0.8)(表S6)。将进行进一步的研究来验证这些miRNA靶对在茶树中的调节功能。microRNA调节茶叶(Camelliasinensis)中儿茶素生物合成CombinedsmallRNAanddegradome

sequencingrevealscomplexmicroRNA

regulationofcatechinbiosynthesisintea

(Camelliasinensis)杂志：PLOSONE研究背景MicroRNAs是一种内源性非编码小RNA，在动植物转录后调控及其他生物学过程中有至关重要的作用。基于碱基互补配对机制，miRNAs主要通过直接切割目标mRNA和抑制目标基因转录这两种方式调节目标基因的表达。前期研究表明，miRNA参与多种植物的生长和发育过程，如：根、叶、花的形态发生，信号转导，激素反应和营养代谢等。植物miRNAs主要通过克隆、生物信息预测、高通量测序和Northern杂交的方法来检测。最常用的技术是高通量测序，不仅经济实惠，而且在低丰度的情况下可以更简单、快速获得大量miRNAs。植物中miRNA主要是通过切割目标基因或者抑制目标基因的表达进行调控，所以目标基因的确定对miRNA功能的分析至关重要。miRNAs目标基因的预测可以通过生物信息的方法，目标基因的鉴定主要通过降解组测序和5’-RLM-RACE方法（RNA连接酶介导的5’cDNA末端的快速扩增），这两种方式还能鉴定miRNA目标基因切割位点，有助于miRNA功能分析。茶树（Camelliasinensis），富含儿茶素，是风靡全球的非酒精饮料之一。儿茶素是茶叶中重要的组成部分，包括脂型儿茶素（如：ECG和EGCG）和非脂型儿茶素（如：EC和EGC）。EGCG是茶叶中含量最丰富的儿茶素并且具有较强的抗癌效果，可以制约癌细胞的生长，抑制雄激素受体的功能并调控癌细胞的生存，血管的生成和移动。基于他们的分子构成，儿茶素可以分为简单儿茶素和脂型儿茶素。在儿茶素的合成过程中有许多酶的参与，如查耳酮合酶（CHS），查尔酮异构酶（CHI），黄烷酮醇4-还原酶（DFR），花青素合酶（ANS），花青素还原酶（ANR）和类黄酮3,5羟基化酶（F3’5’H）。MiRNA被鉴定为转录和转录后水平基因表达的重要调节因子，并且裂解目标mRNA是植物中基因表达的主要调控方式。在茶树中，虽然通过高通量测序和芯片技术发现了许多保守的以及新的miRNAs，但是miRNAs直接调控儿茶素生物合成还没有明确的定义。此项研究中，研究人员通过高通量测序鉴定茶叶中保守的以及新的miRNAs，再通过5’-RLM-RACE方法分析潜在的目标miRNAs。通过表达模式分析进一步筛选儿茶素积累过程中潜在的miRNAs。结合5’-RLM-RACE实验和表达模式分析，研究人员发现了一些新的调节儿茶素生物合成途径中基因切割的调控因子。材料和方法实验材料茶树1005，取叶片（包括芽，第一叶，第二叶，第三叶，第四叶，第五叶，成熟叶），进行混合，提取总RNA。茶树1005，取叶片（包括第一叶，第三叶，成熟叶），进行qRT-PCR表达分析和儿茶素含量测定。测序平台：Illumina

HiSeq2500

（BiomarkerTechnologyCo.）技术路线实验结果1.茶叶中miRNA的初步分析从提取的总RNA中构建smallRNA文库，测序质控后得到19，567，691条cleanreads，与数据库比对发现有18.83%的rRNA，1.23%的tRNA，0.01%的smallnuclearRNA，0.07%的重复序列，其中79.85%的序列没有功能注释，可以将这些没有功能注释的序列用来做下一步的miRNA的预测和鉴定。根据smallRNA的测序长度分布图可以得出，miRNA的长的主要分布在20-25nt之间，丰度最高的是24nt（47.89%）。这个长度分布和其他栽培茶以及其他植物报道的结果非常相似。2.茶叶中保守miRNAs的鉴定将没有功能注释的cleanreads与miRBase（植物已知保守miRNA数据库）进行比对，共获得69个保守的miRNAs，分别属于62个家族。根据长度分布发现，这些保守的miRNAs的长度主要集中在18-25nt之间，长度主要集中在24nt（46.385），其次是21nt。对高通量测序的miRNA片段进行分析，鉴定的保守miRNA中，readvalues低于1000的占91.3%的比例，其中readvalues低于10的占56.52%的比例。研究人员还发现了一些高表达(readvalues大于1000)的miRNA家族，如miR165a和miR396a。另外，在不同家族中的miRNAs表达量差异较大，并且在同一家族中各miRNAs之间的表达量也有较大差异。这些数据表明，不同家族miRNA的表达模式不同，意味着不同的miRNAs在茶树生长发育过程中的作用不一样。3.茶叶中新miRNAs的鉴定通过miRDeep2和Mfold软件分析，共鉴定出47个新的miRNAs，进一步对这些新miRNA进行片段长度和表达量分析。新miRNA跟保守miRNA长度分布相似，主要集中在18-25nt之间，最集中的长度是24nt和21nt。另外，新miRNA的表达量比保守miRNA的低，新miRNA中表达量最高的只有4517个readvalues。

研究人员将这些新的miRNA与其他植物中已知的miRNA进行比对，揭示了许多同系物。除了三个miRNA归为同一个家族外，绝大多数的miRNA可以被分为独立的家族。研究者还对新miRNA的前体进行了分析，发现他们都有一个发卡环结构，长度在84-114bp。4.GO功能富集和KEGG通路分析目标miRNA为了研究茶树miRNA的功能，研究人员运用TargetFinder软件和转录序列对上述miRNA进行目标基因预测。结果显示，其中97个miRNA对644个目标基因有调控作用。再将644个目标基因进行GO和KEGG通路富集分析：GO富集分析发现这些目标基因主要富集在细胞、细胞器、细胞膜、连接活性、转运活性、新陈代谢和细胞进程等功能条目；KEGG通路富集发现366个目标基因参与36个代谢网络相关，主要参与糖酵解、柠檬酸循环、氨基酸代谢、光合作用、脂肪酸代谢、嘌呤嘧啶代谢、氧化磷酸化、植物病原体相互作用、初级代谢产物和次级代谢产物过程。miRNA靶向基因降解组测序和功能分析为了进一步预测和鉴定miRNA靶向基因，研究团队构建了降解组文库并进行深度测序，结合转录组数据和上述获得的miRNAs，通过TargetFinder软件预测到216个靶向基因被97个miRNAs调控。在这些靶向基因中，降解组测序鉴定了26个基因的26个切割位点，被16个miRNA家族的19个miRNAs进行转录后调控，如表1。表1.通过降解组测序鉴定茶树1005中miRNA靶向基因基于5’-RLM-RACE技术对目标断裂位点的验证研究人员采用5’-RLM-RACE的方法，对其中5个有注释的miRNA（来自降解组测序）切割位点进行验证。结果显示，目标基因comp152929被csn-miR396a1和

csn-miR396a2共同调控，切割位点在目标基因的第11-12个核苷酸处；两个基因comp159882和comp157894同时被miRNA167a调控，且有共同的切割位点，在目标基因的第11-12个核苷酸处；另外，miRNA394a调控comp156493，切割位点有两处，分别为第10-11，17-18个核苷酸处；同样的，novel-miR2调控comp145093，切割位点也有两处，分别为第10-11，12-13个核苷酸处。5’-RLM-RACE的实验验证了这些降解组分析的结果，另外一些切割位点有待进一步的验证。7.茶叶中miRNA的表达模式分析对茶树1005叶片儿茶素含量的研究发现，儿茶素在不同叶片中的的含量由高到低排序为：第一叶，芽，第二叶，第三叶，成熟叶。第一叶，第三叶和成熟叶的儿茶素含量有显著差异。为了探索茶叶中miRNAs与儿茶素合成相关性，研究人员采用qRT-PCR的方法分析第一叶、第三叶以及成熟叶中miRNA（readvalues高于平均值）表达。通过表达模式的成簇分析将这些miRNA分成三组。第一组，miRNA表达模式与儿茶素含量成正相关，分别有novel-miR10,novel-miR13,novel-miR19,csn-miR165a,csn-miR170,csn-miR2593e和novel-miR12；第二组，miRNA表达模式与儿茶素含量成负相关，分别有novel-miR1,novel-miR2,csn-miR160a,csn-miR162a,csn-miR394和csn-miR396a；第三组，miRNA表达模式与儿茶素含量没有显著相关性，有csn-miR4380a。8.调控儿茶素生物合成基因miRNA的鉴定为了深入了解miRNA在调控儿茶素合成代谢中的功能，研究人员将高通量测序获得的miRNA跟NCBI数据库以及RNA测序的儿茶素生物合