双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景

PAGE4-双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景1双向电泳技术1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。1.2双向电泳技术的原理双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一。它利用了各种蛋白质等电点和分子量的不同来分离复杂蛋白质组分，具有较高的分辨率和灵敏度，目前已成为复杂蛋白质组分检测和分析的最好的生化技术。IPG-DALT系统双向电泳技术原理简明：首先利用等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF)将蛋白质沿pH梯度分离至各自等电点(isoelectricpoint,pI)，通过电荷分离蛋白质；然后沿垂直的方向以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulphatepolyacryla-midegelelectrophoresis,SDS)，通过分子量分离蛋白质。所得蛋白双维排列图中每个点代表样本中一个或数个蛋白质，而蛋白质的等电点、分子量和在样本中的含量也可显现出来。蛋白双向电泳的分辨率和灵敏度很高，一般可分离1000～3000个蛋白质,最高可分辨11000个蛋白质，pI差别小于0.003个pH单位也可以被分辨。目前在国际蛋白质数据库如SWISS-PROT和PIR中有大量的标准IPG-DALT双向电泳图谱可供查阅。2双向电泳技术在生物医学中的应用现状双向电泳技术在生物医学的研究中发挥着重要作用,可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、蛋白质修饰等。病原微生物的蛋白质组学研究，可以了解其毒性因子、致病机理以及药物抗性等方面，对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。2.1双向电泳技术在病原微生物致病机理研究中的应用结核分枝杆菌是病原微生物研究的一个重点，Jungblut等利用双向电泳技术对结核分枝杆菌H，Rv和作为疫苗的BCG菌株的比较蛋白质组分析，有毒和无毒的菌种之间存在25种重要蛋白质的差异，包括rplL和IJeuA编码的持家蛋白质、潜在致病性因子和一些假想蛋白质；通过双向电泳技术分析对培养基和细胞内生长的细菌进行比较，发现感染巨噬细胞的军团菌、布鲁氏菌、沙门氏菌中分别有一些特殊蛋白被诱导或被阻遏。此外，蛋白质组学双向电泳技术可作为致病微生物临床隔离群区分的可靠参数之一。Jungblut等对4个幽门螺杆菌临床隔离群的比较蛋白表达图谱研究发现，按地区来源可以明显分成两组。对29株李斯特菌属(Listeria)分离株的蛋白质组研究可归为6个亚类，其中19株产单核细胞李氏菌分为2个簇，这些与其他方法所得结果一致。在对流感嗜血杆菌研究中发现，实验室培养的和临床分离的遗传背景相同的菌株出现了新的ORF，对临床分离株NCTC8143进行双向电泳，发现色氨酸酶的含量较高，而实验室培养的菌株中则没有色氨酸酶。2.2双向电泳技术在病原微生物药物抗性基因功能研究中的应用双向电泳技术可以进行微生物抗性机理的研究,Diffes等对DivercinV41抗性和野生型的产单核细胞李斯特氏菌进行2-DE分析，发现至少在17个蛋白质存在差异，抗性菌株中缺乏野生型菌株中的9个蛋白质，而新增8个蛋白质，其中只有1个RI是存在于已知该菌的数据库中，为鞭毛蛋白；机会致病真菌如念珠菌属产生了许多的耐药菌株。最近研究发现，伊曲康唑类化合物通过抑制真菌细胞壁的d-葡萄糖的合成而起作用，而且对耐真菌药物的菌株起作用Bruneau研究。由于某些电泳法设备简单，操作方便，具有高分辨率及选择性特点，已成为医学检验中常用的技术。目前病原微生物蛋白质组学和肿瘤蛋白质组学的研究正在兴起，而双向电泳技术是研究蛋白质组学最关键的技术之一，广泛应用于生物医学领域的研究工作，如通过寻找差异蛋白质，发现疾病相关的蛋白质，寻找用于诊断的疾病相关标记分子，寻找疾病相关的蛋白质药靶，以用于药物设计，研究疾病的致病机理等。随着蛋白质组学相关技术的发展，如液相2-DE，蛋白质芯片结合SELDI-MS技术的应用，蛋白质组学必将得到进一步的发展，并在疾病的发病机制、诊断和治疗方面发挥重要的作用。蛋白质组双向电泳技术为人类疾病，特别是恶性肿瘤的早期诊断和治疗方面已显示出了广阔的前景，必将造福于人类。参考文献：[1]CashP.ProteomicsinmedicalmicrobiologElectrophoresis,2000,21(6):1187-1201[2]刘上峰,傅俊江,综述,等.双向电泳技术原理及其应用[J].国外医学、生理、病理科学与临床分册,2002,22(2):197-199.[3]CorgA,ObermaierC,BoguthG.Thecurrentstateoftwo-dimensionelectrophoresiswithimmobilizedpHgradient..Electro-phoresis,2000,21(6):1187-1201[4]JungblutPR,SchaibleUE,MollenkopfHJ,etal.ComparativeproteomeanalysisofMycobacteriumtuberculosisandMycobacteriumbovisBCGstains:towardsfunctionalgenomicsofmicrobialpathogens.MolecularMicrobiology,1999,33,33:1103-1117[5]JungblutPR，BurnannD，HaasG，eta1．ComparativeproteomeanalysisofHelicoboeterpylori．MolecularMierobiol，2005，36：7l0-725．[6]DiffesF，JenoeP，BoyavalP．Useoftwo-DimensionalelectrophoresistostudydifferentialproteinexpressionindivercinV41-resistantandwild—typestrainsoflisteriamonocytogenes．ApplEnvironMicrobiol，2000，66：43l8-4324．[7]BmneauJM，MallhtI，TagatE，eta1．DruginducedproteomechangesinCandidaalbicans：comparisonoftheefectofbeta(1，3)glucansynthaseinhibitomandtwotriazoles，fluconazoleanditraconazole．Proteomics，2003，3：325-336．[8]KahngHY，ChoK，SongSY，eta1．Enhanceddetectionandcharacterizationofprotocatechuate3，4一dioxygenaseinAcinetobacterlwofiiK24byproteomicsusingacolumnse-paration．BiochemBiophysResCommun，2002，295：903-909．[9]WadsworthJT,SomersKD,CazaresLH,etal.SerumproteinprofilestoIdentifyheadandneckcancer[J].ClinCancerRes,2004,10(5):1623-1632.[10]KageyamaS,IsonoT,IwakiH,etal.Identificationbyproteomicanalysisofcalreticulinasamarkerforbladdercancerandevaluationofthediagnosticaccuracyofitsdetectioninurine[J].ClinChem,2004,50(5):857～866.[11]AlaiyaA,RoblickU,EgevadL,etal.Polypeptideexpressioninprostatehyperplasiaandprostateadenocarcinoma[J].AnalCellPathol,2000,21(1):1～9.[12]XiongXD,LiEM,XuLY,etal.Separationandidentificationofdifferentiallyexpressednuclearmatrixproteinsbetweenhumanesophagealimmortalizedandcarcinomatouscelllines[J].WorldJGastroenterol,2003,9(10):2143～2148.[13]HewettPW.Identificationoftumour-inducedchangesinendo2thelialcellsurfaceproteinexpression:a