应用荧光定量pcr技术监测玄武湖蓝藻水华

应用荧光定量pcr技术监测玄武湖蓝藻水华

自20世纪90年代以来，多聚酶链反应（pcr）技术已广泛应用于医学诊断、农业生物技术和环境生物监测。近年来，该技术已在国外应用于有害绿藻的研究。2005年7月初,玄武湖发生了以微囊藻(Microcystis)为优势种群的大面积蓝藻水华1监测方法1.1控制点、设计和频率根据玄武湖湖区特征,在全湖设置4个监测点。参照《水和废水监测分析方法》(第四版)1.2荧光定量pcr测定1.2.1样品的采集和保存用采水器采集表层水样。取水样200mL以上,采用真空抽滤法富集藻样于孔径0.45μm滤膜,采集的滤膜样品迅速置于冰盒(0℃)保存,带回实验室后置于-20℃条件下保存,保存期<1a。1.2.2蛋白质提取dna将含有藻细胞的滤膜用剪刀剪碎装入离心管,加入溶解缓冲液(lysisbuffer)(10mMTris,100mMNaCl,1mMEDTA,pH9)2mL,振荡2min;加入100mg/mL溶菌酶(lysozyme)20μL,37℃水浴20min;加入20mg/mL蛋白酶K(proteinaseK)6μL和10%十二烷基磺酸钠(SDS)105μL,50℃水浴2h;然后加入1倍体积平衡酚(tris-phenol)2.5mL,振荡并12000rpm离心8min;吸取上清液加入1倍体积的氯仿(chloroform-isoamyl),振荡并12000rpm离心8min,再取上清液加入2倍体积的冰乙醇(icecoldethanol)和0.1倍体积的乙酸氨(ammoniumacetate)(10M),-20℃条件下冰冻1h;离心倒掉上清液后,加入70%的冰乙醇5mL,充分振荡并12000rpm离心5min,最后缓慢倒掉乙醇,在无菌操作台上用风机风干液体。风干后加入200μL灭菌双蒸水,50℃水浴30min,将提取的DNA溶解。取出后离心转入1.5mL离心管中-20℃冷藏。1.2.3荧光定量pcrms检测微囊藻相关基因片段的表达反应液终体积25μL:蒸馏水9.5μL,SYBRGreenRealtimePCRMasterMix(TOYOBO,日本)12.5μL,正向反引物(10μM)各1μL,样品溶液1μL。在ABIPrism7000型荧光定量PCR仪完成。使用的DNA引物序列见表1,其中测定微囊藻细胞数的用16SrRNA基因,而测定有毒微囊藻数目则使用微囊藻毒素合成基因的片段(mcyB)。微囊藻M16引物对应反应条件及参数:预变性95℃3min;变性95℃15s;退火53℃30s;延伸72℃30s。蓝藻特异16s引物及微囊藻毒素基因mcyB引物反应条件及参数:预变性95℃3min;变性95℃15s;退火59℃30s;延伸72℃30s。1.3鲁哥氏溶液浓缩参照《水和废水监测分析方法》(第四版)。野外水样采集后用1.5%鲁哥氏液固定,静置沉淀24h以上,浓缩后镜检。镜检采用0.1mL显微计数框法,双片计数取其平均值,如两片计数结果个数相差15%,则进行第三片计数,取其中个数相近两片的平均值。2结果与讨论2.1蓝藻水华变质原因分析玄武湖蓝藻水华主要以微囊藻为优势种群,该次调查使用荧光定量PCR法分别监测了玄武湖各湖区水中蓝藻数量、微囊藻数量和有毒微囊藻数量。蓝藻数量为1.56×10微囊藻数量为0~3.62×10有毒微囊藻数量为0~3.48×10微囊藻在蓝藻中的比例随着蓝藻数量的下降而下降,最高为2005年8月,最低为12月,在次年1—5月一直维持在较低水平,并在6—9月重新上升,这主要是与蓝藻、微囊藻喜高温的生长特性有关。有毒微囊藻在微囊藻中的比例变化则不同,冬春季高,夏秋季低,其原因需进一步探讨。蓝藻水华的最大危害是产生微囊藻毒素,威胁饮用水源地安全。因此,蓝藻水华是否产毒、毒性大小是人们最为关心的问题。目前检测微囊藻毒素的方法主要有生物检测法、高效液相色谱法(HPLC)及酶联免疫分析(ELISA)等,这些方法一般需要样品量大,且水体中毒素产生后方能检测。实时定量PCR法可同步监测蓝藻、微囊藻和有毒微囊藻的数量,及时反映微囊藻和有毒微囊藻的动态变化,需要的样品量少,时效性强,可应用于大批量水样的蓝藻水华和有毒微囊藻的监测与预警。2.2微囊藻的形成程度从2005年8月—2006年11月对玄武湖微囊藻周年检测中共检测样品数73个,当水中微囊藻数量大于10蓝藻水华的程度判别与预警级别,国内外资料均有报道3荧光定量pcr技术的报告与蓝藻水华的应用规划3.1两种方法所得结果对比基分别用实时定量PCR法与显微计数法检测微囊藻培养藻种,结果表明对实验室内培养的成单细胞的微囊藻藻种,这两种方法所得结果差异不大。而比较两种方法对玄武湖水样的监测结果,表明在检测自然水体中的微囊藻等蓝藻时,实时定量PCR法更为适合和准确,且其检出限比传统的显微计数法低1~2个数量级,所以在微囊藻水华形成早期,实时定量PCR法的优势更为明显,可以应用于蓝藻水华的早期预警预报工作。3.2寡可代表微囊藻毒素的产生能力实时定量PCR法可同步监测蓝藻、微囊藻、有毒微囊藻。有毒微囊藻数量的多寡可代表微囊藻毒素的产生能力。有必要通过进一步研究水中有毒微囊藻数量与微囊藻毒素毒性大小的关系,建立以有毒微囊藻为标准的预警预报系统,及时预测水中微囊藻毒素的可能水平,为保障水体生态环境安全提供科学依据。3.3越冬与复苏研究目前中国湖泊蓝藻水华发生频率高、规模大、程度重、持续时间长,开展蓝藻水华成因及其时空分布的研究,以及蓝藻越冬与复苏等的研究十分必要。而在进行相关研究时,由于蓝藻在冬季越