当归提取物的提取、纯化及生物活性测定

当归提取物的提取、纯化及生物活性测定

当归是一门辩证的植物，当归属植物（oliv.）可以滋润根部。1材料和方法1.1纤维素和酸钠的提取当归先由“甘肃省药品研究院”鉴定合格,后对当归进行提取,去除不利于机体吸收的纤维素和鞣酸,再对其分别用乙醇和水提取,最后浓缩成褐色膏状液体。有效成分包括皂甙(平均含量1.57g/100g)、黄酮(平均含量2.17mg/100g)和多糖(平均含量0.13mg/g)等。1.2实验动物、饲料昆明种小鼠,SPF级,由中国农业科学院兰州兽医研究所提供,实验动物生产许可证号:SCXK(甘)2010-0001,Wistar大鼠,SPF级,由甘肃中医药大学科研实验中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(甘)2011-0001。实验动物饲料由北京科奥协力饲料有限公司提供,生产许可证号:SCXK(京)2014-0010。饲养环境为屏障环境,温度:22±1℃,相对湿度:42%~45%。所有实验动物在试验前均适应性喂养3d。1.3中毒试验方法1.3.1按量刑法实验采用GB15193.3-2014标准,按限量法实验。当归提取物配制最大浓度为0.8g/ml,染毒剂量为16.0g/kg·bw。1.3.2重复试验设计采用GB15193.4-2014标准,用平板掺入法试验。首次试验设0.2、0.5、1.0、2.5和5.0mg/皿5个剂量,重复试验设0.008、0.04、0.2、1.0和5.0mg/皿5个剂量,2次实验均设立自发回变对照组、溶剂对照组(无菌蒸馏水)和阳性对照组。1.3.3环磷酰胺检测采用GB15193.5-2014标准,设2.5、5.0和10.0g/kg·bw3个试验组,另设阴性对照组(蒸馏水)和阳性对照组(环磷酰胺40mg/kg·bw)。1.3.4丝裂霉素对大鼠体内的影响采用GB15193.8-2014标准,设2.5、5.0和10.0g/kg·bw3个试验组,另设阴性对照组(蒸馏水)和阳性对照组(丝裂霉素C2mg/kg·bw)。1.3.5分组及测定指标采用GB15193.14-2003标准,设8.0、4.0、2.0g/kg·bw3个试验组,另设阴性对照组(蒸馏水)及阳性对照组(阿司匹林0.28g/kg·bw)。2结果2.1动物不良反应观察1次灌胃16.0g/kg·bw当归提取物30min后雌雄动物均未出现不良反应,连续观察14d期间内动物未见明显中毒症状,亦无死亡。依据急性毒性分级评价标准规定,该受试物属实际无毒级。2.2鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验试验重复2次,2次试验各剂量组回变菌落数均未超过空白对照菌落数2倍,亦无剂量-反应关系,对鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102和TA15355株试验菌株,在加与不加S时,均无致突变作用。2.3小鼠红细胞微核试验结果受试物各剂量组微核率与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),该受试物哺乳动物红细胞微核试验结果阴性。2.4小鼠精母细胞染色体畸变试验结果受试物各剂量组小鼠精母细胞染色体畸变发生率与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),丝裂霉素阳性对照组与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),该受试物小鼠精母细胞染色体畸变试验结果为阴性。2.5畸形试验2.5.1投资后孕鼠宫连胎体重、净增重变化试验过程中各组动物生长正常,8.0g/kg·bw组孕鼠增重与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),但无生物学意义;2.0和8.0g/kg·bw组孕鼠子宫连胎体重分别与阴性对照组比较,有统计学意义(P<0.05),但无生物学意义;8.0g/kg·bw组孕鼠净增重与阴性对照组比较,有统计学意义(P<0.05),但无生物学意义;其余各剂量组各指标与阴性对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。各组均无吸收胎,与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);阴性对照组有1个晚死胎,死胎率为0.70%,其余各组无死胎,与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P<0.05)。2.5.2对胎鼠体重、腰椎、四下肢骨、鱼骨发育的影响各剂量组及阿司匹林组胎鼠的身长与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05),2.0g/kg·bw组和阳性对照组胎鼠体重与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),但无生物学意义,其余各剂量组胎鼠体重与阴性对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。各剂量组胎鼠的头顶骨、颈椎、胸腰椎、四肢骨、肋骨和胸骨发育的各项指标与阴性对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。阳性对照组的头顶骨、颈椎、胸腰椎、四肢骨发育的各项指标与阴性对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05),但肋骨和胸骨发育与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。各剂量组及阴性对照组胎鼠内脏发育均未见异常。2.5.3两组患者骨畸形率、锁骨畸形率、胸径畸形率比较各剂量组及阴性对照组均无畸形。阳性对照组动物畸形窝数率为33.3%,总畸形率为12.2%,胸骨畸形(无胸骨、缺5或6)率为20.3%,肋骨畸形(多肋)和胸椎畸形(多胸椎)率均为8.5%,阳性对照组畸形窝数、总畸形率、胸骨畸形率、肋骨畸形率、胸椎畸形率与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。2.690d口腔毒性试验2.6.1对大鼠体重、第2周、第1周和第11周进量的影响各试验组动物总体生长状况良好,体重逐周增长,未见中毒体征及死亡。4.0g/kg·bw组的雄性动物体重在第5周、第8周和第11周体重明显低于阴性对照组(P<0.05),有统计学意义,其余各剂量组动物其余时间体重与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.0g/kg·bw组雌性动物的第4周和第13周、4.0g/kg·bw组雄性动物的第2周、第10周和第11周进食量与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),其余各剂量组动物其余时间进食量与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各剂量组动物食物利用率与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。各剂量组动物体重总增重、总进食量、总食物利用率各指标与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05),说明该当归提取物对大鼠体重增长、食物利用率无明显影响。2.6.2本实验室历史对照值与统计学意义试验中期:2.0g/kg·bw组雌性动物的白细胞总数、淋巴细胞百分比,4.0和8.0g/kg·bw组雄性动物的淋巴细胞百分比与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),但其值仍在本实验室历史对照值范围内,不认为存在生物学意义。其余各剂量组大鼠的血液学指标与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。试验末期:2.0g/kg·bw组雄性动物的血红蛋白、白细胞总数与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),但其值仍在本实验室历史对照值范围内,不认为存在生物学意义。其余各剂量组大鼠的血液学指标与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。2.6.3大鼠的谷丙转氨酶检测试验末期各项生化指标均在本实验室历史对照值范围内,2.0g/kg·bw组雌性动物的血糖、4.0g/kg·bw组雄性动物的甘油三酯,8.0g/kg·bw组雌性动物的谷丙转氨酶与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),但无生物学意义。其余各剂量组大鼠的血液生化指标(丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总蛋白、血清蛋白、胆固醇、三酰甘油、血糖、尿素氮和肌酐)与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),说明该当归提取物在本试验条件下对动物的血液生化指标无明显影响。2.6.4影响大鼠器官大小体比的影响各剂量组大鼠脏器重量和脏/体比值均在正常范围,且与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.6.5主要脏器位置各组动物外观、体表、皮肤均未见异常,无被毛脱落、皮肤破损等,肛周无分泌物,胸腹腔膜光滑,未见出血点及积气、积液,肉眼观察其他各组动物主要脏器位置正常,未见明显病变。3讨论当归提取物化学成分主要包括苯酞类化合物、有机酸类、黄酮类、香豆素类、多糖类、氨基酸和微量元素等多种成分1.3.6