瑞替普酶在乳酸乳球菌中的表达及溶栓活性

瑞替普酶在乳酸乳球菌中的表达及溶栓活性

r-73？这是一个短的突变体。这是一个带缓冲液和非糖基化的蛋白质。这是tpa的两个区域和s区域，这些区域可以激活纤维酶原的生物活性。rpa属于第三代溶菌酶，具有长体内半衰期、高溶菌酶活性和低副作用等优点。目前,科研工作者已经在多种表达系统中对rPA的重组表达进行研究,但其效果均不甚理想:大肠杆菌细胞壁脂多糖是药品内毒素的主要来源,rPA单剂用量通常又是其他重组蛋白如rhGCSF、INFa2b的30倍以上,因而对rPA大肠杆菌重组产品的纯度及内毒素控制要求非常高.这造成生产后期纯化工艺复杂,药物成本增加乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是公认对人体安全的(generallyregardassafe,GRAS)食品级微生物.利用乳酸菌表达系统重组表达蛋白质多肽类药物可以有效提高产品的安全性,并可以一定程度上简化后期纯化工艺.为建立rPA的乳酸菌表达系统,本研究将rpa基因亚克隆至乳酸菌表达质粒pCYT.同时,为了提高rPA在乳酸菌NZ9000中的稳定性,将rPA与葡萄球菌(Staphylococcal)耐热核酸酶(nuclease,Nuc)进行了融合表达,为rPA的基因工程生产提供了新的思路与研究基础.1材料和方法1.1蘑菇和颗粒EscherichiacoliDH5α由本实验室保存,质粒pET22b-rpa为本实验室前期构建1.2培养基的制备LB液体培养基:称取胰蛋白胨10,g、酵母提取物5,g、NaCl10,g,加入800,mL去离子水溶解,调pH至7.4,定容至1,L.121,℃高压蒸汽灭菌20,min.GM17液体培养基:称取M17培养基42.3,g、葡萄糖5,g,加入800,mL去离子水溶解,调pH至7.4,定容至1,L.115,℃高压蒸汽灭菌20,min.恢复培养基:称取M17培养基42.3,g、葡萄糖5,g、MgCl24.07,g、CaCl20.22,g,加入800,mL去离子水溶解,调pH至7.4,定容至1,L.115,℃高压蒸汽灭菌20,min.EscherichiacoliDH5α,用LB液体培养基,37,℃、200,r/min振荡培养;LactococcuslactisNZ9000用GM17液体培养基,30,℃静置培养.氯霉素的使用质量浓度为10,μg/mL.1.3试剂与标准品限制性内切酶NsiⅠ、HindⅢ、SalⅠ、T4,DNA连接酶、RNase-FreeDNaseI,Fermentas公司;PfuDNA聚合酶、DNA回收试剂盒,康为试剂公司;EasyTaqDNA聚合酶,全式金生物技术有限公司;质粒提取试剂盒,索来宝公司;Nisin,Sigma公司;M17培养基,青岛海博公司;RNA提取试剂盒,Invitrogen公司;RNA酶抑制剂,上海生工生物工程有限公司;tPA抗体,abcam公司;rPA标准品,中国食品药品检定研究院;实验所用其他试剂为市售国产分析纯试剂.紫外可见光分光光度计,Thermo公司;电击转化仪、蛋白质电泳装置,BioRad公司.1.4pcr扩增表达以实验室前期构建的大肠杆菌表达质粒pET22b-rpa为模板,根据rpa基因序列和pCYT上多克隆位点设计引物,引物信息见表1.以质粒p22b-rpa为模板,进行PCR扩增rpa基因.其中pCYT-rpa的构建以P1、P2(下划线分别为:NsiⅠ和HindⅢ酶切位点)为引物,PCR反应条件为:94,℃预变性5,min,94,℃变性45,s,60,℃退火45,s,72,℃延伸2,min,共循环30次,72,℃延伸10,min.将PCR产物与表达载体pCYT分别用限制性内切酶NsiⅠ和HindⅢ双酶切后(pCYT上原有的nuc标签将被切除),通过琼脂糖胶电泳纯化,经T4连接酶16,℃连接.pCYT-nuc-rpa的构建以P3、P4(下划线分别为:HindⅢ和SalⅠ酶切位点)为引物,PCR反应条件与上述条件相同,扩增获得目的基因rpa.将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,涂布于含10,μg/mL氯霉素的LB平板,37,℃培养12,h.次日挑取单菌落增菌,提取质粒进行双酶切后电泳鉴定,送至Invitrogen公司测序.1.5菌株的诱导诱导诱导诱导表达将测序正确的重组质粒pCYT-rpa和pCYT-nuc-rpa(图1)电转化表达菌株乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞,电转化条件为:电压2,000,V、电容25,μF、电阻200,?,电击后迅速加入1,mL恢复培养基,30,℃恢复培养2,h,涂布于含10,μg/mL氯霉素的GM17固体平板,30,℃厌氧培养48,h.挑取单菌落,进行PCR验证.将含有目的基因的重组菌30,℃厌氧过夜培养,第2天以4%的接种量转接于10,mLGM17液体培养基中,30,℃静置培养至A1.6r-pcr分析rpa基因的发现1.6.1逆转录pcr检测rna离心收集3,mL诱导后的菌体,用灭过菌的TE缓冲液洗涤3次,最后用200,μLTE缓冲液吹悬菌体,加入终质量浓度为20,mg/mL的溶菌酶,37,℃水浴30,min.每管加入0.5,mLTrizol,室温放置10,min,使其充分裂解,然后轻轻吹匀.每管加入100,μL冰冷的氯仿,手动颠倒2,min,室温放置5,min.4,℃、13,000,r/min离心15,min.吸取上层水相至另一个EP管中.每管加入250,μL冰冷的异丙醇,上下晃动2,min,冰上放置10,min,-20,℃放置1,h,沉淀RNA.4,℃、13,000,r/min离心10,min.RNA沉于EP管底部,轻轻弃去上清液.加入500,μL体积分数为75%的冰冷乙醇,剧烈振荡EP管以悬浮沉淀,4,℃、13,000,r/min离心10,min.轻轻弃去上清液,打开EP管,室温放置10,min,使残余的乙醇挥发.每管加入20,μLDEPC处理过的水溶解RNA样品,60,℃放置10,min.将提取的RNA经紫外可见分光光度计测定浓度后,加入RNase-FreeDNaseⅠ于37,℃消化30,min后,利用随机六聚体引物,经M-MLV逆转录酶反转录为cDNA.1.6.2rt-pcr检测乳酸菌nz2005依据rpa基因序列设计扩增引物rpa-RTF和rpa-RTR;以L.lactisNZ9000的16SrRNA作为RT-PCR反应的内参基因,上游和下游引物分别为16SF和16SR(表1).RT-PCR反应体系为:EasyTaqbuffer(10×)2.5,μL,dNTP1.0,μL,上游和下游引物(10,μmol/L)各0.25,μL,cDNA模板1.0,μL,EasyTaqDNA聚合酶(5,U/μL)0.25,μL,Nuclease-Freewater19.25,μL,总计25.0,μL.优化后的PCR反应条件为:94,℃预变性5,min,94,℃变性45,s,56,℃退火45,s,72,℃延伸20,s,30个循环,72,℃延伸10,min.所有待测样品均设3个重复,并用Nuclease-Freewater代替模板作为阴性对照,以乳酸菌NZ9000的16SrRNA作为RT-PCR的内参基因.1.7蛋白凝胶的转发离心收集5,mL诱导后的菌体,用PBS洗涤3次,最后用1,mLPBS重悬菌体,然后进行超声破碎.取等量超声破碎液进行SDS分析.SDS结束后,将凝胶中的蛋白经半干转转印至NC膜上;转印结束后将NC膜浸于质量分数5%的脱脂乳溶液中进行封闭,室温静置封闭1,h;TBST洗去脱脂乳,用tPA兔源单克隆抗体作为第一抗体进行封闭(一抗稀释比例为1∶800),4,℃过夜放置;TBST洗3次,每次10,min;辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG作为第二抗体(二抗稀释比例为1∶5,000),避光封闭1,h,TBST洗3次,每次10,min.利用Odyssey1.8单次给药后rpa及去蛋白活性的检测将菌体破碎液离心后取沉淀,经洗涤液(3,mol/L尿素,体积分数0.6%的TritonX-100,50,mmol/LTris-HCl,2,mmol/LEDTA,pH8.0)于摇床4,℃洗涤1,h,10,000,r/min离心20,min,取沉淀.然后用变性液(8,mol/L尿素,100,mmol/LGSH,50,mmol/LTris-HCl,pH8.0)吹悬,于100,r/min摇床,25,℃变性2,h,10,000,r/min离心20,min取上清液.向上清液中加入等体积的50,mmol/LTris-HCl将尿素浓度稀释至4,mol/L,然后加到透析袋中,于复性液(50,mmol/LTris-HCl,20,mmol/L咪唑,300,mmol/LNaCl,2,mol/L尿素,3,mmol/LGSH,0.6,mmol/LGSSG,pH8.0)中4,℃过夜进行透析复性.最后,采用目前使用最广泛的纤溶活性筛选方法——纤维蛋白平板法对样品的溶栓活性进行分析.取100,μL复性后的rPA及Nuc-rPA蛋白样品,分别点加于纤维蛋白板上,37,℃放置12,h进行溶栓活性分析2结果2.1重组基因rpa表达载体的确定pCYT-rpa和pCYT-nuc-rpa阳性克隆子经扩大培养、提取质粒后,用相应的限制性内切酶对质粒进行酶切鉴定,酶切结果均可看到大小约1,100,bp的片段(图2和图3),与预期片段大小一致,进一步通过序列测定,确认了目的基因rpa正确克隆到pCYT表达载体中,并具有正确的读码框.2.2rpa在重组l.lactisnz9000中的转录水平分析将提取的乳酸菌RNA逆转录成的cDNA进行RT-PCR,结果如图4所示.由图4可知:与L.lactisNZ9000/pCYT相比,rpa重组菌L.lactisNZ9000/pCYT-rpa和L.lactisNZ9000/pCYT-nuc-rpa中可检测到rpamRNA,表明外源基因rpa在两种重组菌中能够有效被转录.2.3小鼠造林后目的蛋白表达量的比较将提取的乳酸菌菌体蛋白进行Westernblot及Quantityone半定量分析,结果如图5所示.由图5可知:目的蛋白rPA和Nuc-rPA在两种重组乳酸乳球菌中均得到了有效的表达,相对分子质量分别为3.9×104和5.3×104,与预测的蛋白相对分子质量一致.对比两种菌株在诱导1,h和诱导2,h时的蛋白表达量可知:在L.lactisNZ9000/pCYT-rpa菌株中,目的蛋白rPA在诱导2,h时比诱导1,h时表达量减少;而融合了Nuc的菌株L.lactisNZ9000/pCYT-nuc-rpa,诱导2,h时的目的蛋白Nuc-rPA与1,h的相比表达量增加,说明融合表达Nuc可降低胞内酶对rPA的降解,提高了rPA的稳定性.2.4rpa及rpa/pa溶栓活性测定将复性后的rPA和Nuc-rPA点加于纤维蛋白