高产-氨基丁酸发酵梨酒的研究

高产-氨基丁酸发酵梨酒的研究

氨基丙烯酸（氨基丙烯酸）是一种非蛋白质的天然氨基酸，广泛存在于植物、动物和微生物中。目前,采用微生物发酵已经开发的富含GABA食品有发酵乳1材料和方法1.1仪器、试验设备鸭梨、雪梨河北省赵县产;溴甲酚绿天津市百世化工有限公司,分析纯;琥珀酸天津市博迪化工有限公司,分析纯;50%乙醛酸溶液上海源叶生物科技有限公司。SP-722E型分光光度计上海光谱仪器有限公司;SPX-250B-II型生化培养箱上海贺德实验设备厂;安捷伦6820高效气相色谱仪美国惠普公司。1.2果汁初筛、分离、培养YPD培养基:葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,酵母浸粉10g/L,琼脂20g/L,pH自然;GABA筛选培养基选择糖分含量高、香气浓、充分成熟、无霉烂果的梨果,去核、不去皮,用螺杆式榨汁机榨汁。分别取100mL果汁于250mL锥形瓶中,并加入适量果渣。加入5%亚硫酸钠溶液,使得果汁SO将发酵后的梨汁进行适当稀释后涂布到GABA筛选培养基上,于30℃恒温培养箱中培养3d。观察菌落颜色和形态,挑取具有酵母形态、绿色较深的菌株进行分离纯化。纯化菌株保藏于试管斜面,并保存于4℃冰箱中。将初筛出的高产GABA菌株,接种YPD液体培养基,活化24h后接种到WL琼脂培养基,30℃培养3d后观察,挑选出浅黄色-绿色、表面光滑、球形突起的、不透明的菌株。将初筛得到的高产GABA菌株,分别接种到100mL发酵培养基、梨汁发酵培养基中,30℃静置发酵6d。待发酵结束后测定发酵液中GABA的含量和酒精含量。1.2.5高产加巴酒祖母的鉴定1.2.6梨汁的制备在100mLYPD液体培养基中,分别接入2~3环斜面保藏的酿酒酵母KS45,30℃、180r/min摇床培养2d。选择新鲜无病的成熟鸭梨,清水洗净、去核后,用螺杆式榨汁机榨汁,并用蔗糖调整其糖度为20%。将150mL梨汁加入250mL的三角瓶中,并按10%接种量接入种子液,用8层干净的纱布封口,在30℃下分别静置发酵4、6、8、10、12d。按10%接种量向150mL梨汁中接入种子液,分别在15、20、25、30、35℃下恒温静置发酵10d。将制备好的梨汁装入500mL三角瓶中,装液量分别控制为100、200、300、400mL,接入10%种子液,分别在30℃下静置发酵10d。1.3分析1.3.1gaba测试梨酒蒸馏后,以正丁醇为内标物,采用气相色谱仪测定其乙醇含量。每个实验设置三个平行实验,测定酒精度,取其平均值。2结果与分析2.1复筛和分子鉴定黄丽华等将自然发酵后的梨汁进行适当稀释后涂布到GABA筛选培养基上,30℃培养3d,其中一个平板的培养结果见图1。观察菌落颜色和形态,挑取出具有酵母形态、绿色较深的菌株进行分离纯化,获得了83株高产GABA酵母菌株。WL培养基对酿酒酵母的筛选可信度达到100%本研究的目的是获得富含GABA的梨酒,因此,复筛时采用了静置发酵。将初筛得到的高产GABA酵母菌株分别接种到发酵培养基进行静置发酵,发酵结束后,检测其中的GABA和酒精含量。实验发现,所有酵母菌株均产生不同浓度的酒精,但均检测不出GABA。分析其原因很可能是由于静置发酵时氧气供给太低造成的。与之相反,当将初筛得到的高产GABA酵母菌株在梨汁发酵培养基进行静置发酵时,发现所有酵母菌株在产生酒精的同时,均可检测到有不同浓度的GABA产生,这说明梨汁中可能含有刺激GABA合成物质。这些刺激GABA合成物质使得酵母菌能够在厌氧条件合成了较多GABA。在梨汁发酵培养基上经过复筛,共获得了8株高产GABA酿酒酵母(表1),其中菌株KS45产生的GABA最多,达到了1.146g/L。从表1中还可以发现,普通酿酒用的安琪酿酒酵母可以产生酒精,但不产生GABA。菌株KS45在高产GABA的同时,仍具有良好的产生酒精的能力,其发酵酒精度达到8%,因此,本研究采用菌株KS45来酿制富含GABA梨酒。菌株KS45的菌落形态特征为:乳白色,球形突起,表面光滑,不透明,奶油状(图2)。酿酒酵母不能利用赖氨酸作为氮源,因而在赖氨酸培养基上不能生长。将复筛所得到GABA产量最高的酵母菌株KS45,接种到赖氨酸培养基进行培养,发现菌株KS45不能在赖氨酸培养基形成菌落,因而基本上可确定菌株KS45为酿酒酵母。为了更加准确和可靠,将菌株KS45送交上海生工生物工程股份有限公司进行了分子鉴定。提取KS45菌株的基因组DNA,用通用引物NS1和NS6进行扩增可知18SrDNA的PCR长度约为1300bp。经测序,菌株KS45的18SrDNA核苷酸序列大小为1335bp,与NCBI数据库序列比对结果显示:菌株KS45的18SrDNA核苷酸序列与酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)18SrDNA(GeneBank登记号为EU011664.1)核苷酸序列一致性达到99%,因此将菌株KS45鉴定为酿酒酵母。2.2酿酒酵母发酵过程中gaba的变化将酿酒酵母KS45接种到梨汁中进行酒精发酵,定时取样监测梨汁中GABA含量和酒精度的变化,实验结果见图3。从图3中可以看出,在发酵的前4d,随着酵母菌体的生长和发酵时间的延长,酒精浓度急剧上升,并在第4d达到最高值,9.5%;而与此同时,梨酒中GABA含量却逐渐下降,在第4d达到最低值,0.88g/L。在葡萄酒酿造过程中也观察到类似的现象,可能是GABA用作氮源而被菌体吸收利用温度是影响酿酒酵母生长和酒精发酵的一个重要因素。如图4所示,当发酵温度较低(15~25℃)时,菌体产生GABA的量很低。发酵温度为30℃时,菌体产生GABA的能力最强,发酵液中GABA浓度达到最大值,2.427g/L。当发酵温度升高至35℃,菌体产生GABA量显著下降。胡超等装液量的多少直接影响酿酒酵母酒精发酵过程中氧气的供给。从图5中可以看出,随着装液量的增加,梨酒的酒精度逐渐上升,而梨酒中GABA含量却急剧下降。关于GABA生物合成的机理研究基本上都集中于乳酸菌,而对酿酒酵母合成GABA的机理国内外都极少研究。关于酿酒酵母合成GABA是否需氧,国内外文献均没有明确说明。蒋冬花等3基于gaba的梨酒发酵本研究从梨果实表面筛选出了8株既能高产GABA,又有较强产酒精能力的酵母菌株,其中菌株KS45产生GABA能力最强,达到了1.146g/L。经鉴定,菌株KS45为酿酒酵母。实验发现,只有在含有梨汁的发酵培养基中,筛选出的酵母菌才能在静置发酵时高产GABA,这表明梨汁中可能含有刺激酿酒酵母合成GABA的物质。将酿酒酵母KS45按10%接种量接入到鸭梨汁中,30℃下静置发酵10d,获得了富含GABA的梨酒,其酒精度为7.0%,GABA含量达到了2.427g/L,比发酵前(梨汁)增加了2倍多。实验还发现,在富含GABA梨酒发酵过程中,GABA产生的同时伴随着酒精的消耗,呈现耦合关系,其机理尚不清楚。随着发酵温度的升高,梨酒的最终酒精度显著下降。装液量对GABA产生有很大影响。随着装液量的增加,梨酒中GABA含量急剧下降,这可能与氧气供给不足有关。1.2.1培养基1.2.2母字母组的丰富培训1.2.3高产加巴酒和母酒的初始筛选1.2.4高产加巴酒祖母的再筛选将复筛所得到GABA产量最高的酵母菌株KS45,进行赖氨酸培养基鉴定1.2.6.1.发酵培养基1.2.6.2