瘤胃微生物总dna提取方法的研究进展

瘤胃微生物总dna提取方法的研究进展

肿瘤胃的微生态系统非常复杂，有各种复杂、多样和不受影响的微生物，包括肿瘤细菌、原生动物、细菌和厌倦感。根据研究，肿瘤胃中的细菌数量最大，肿瘤胃内容物中的细菌数量达到10%。对于瘤胃微生物总DNA的提取，其最关键的一步是如何有效的裂解细胞。一般裂解瘤胃微生物细胞的方法包括以下几种，一种是物理方法如玻璃珠研磨震荡法1材料和方法1.1样品采集采集瘤胃内容物及瘤胃液，混匀，然后四层纱布过滤，滤液10000g离心5min，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，放置-70℃保存1.2细胞破碎方法的比较试验采用珠磨法等4种物理方法进行瘤胃微生物的细胞破碎，采用SDS等9种化学方法进行细胞破碎液的DNA提取，因此，本实验进行4×9=36种提取方法的比较，每种方法均取样品450μL。1.2.1冰选择组合破碎材料见表1玻璃珠研磨法（简称B）：样品中加1g，直径为150μm的玻璃珠，加抽提液，放置迷你珠磨仪上破碎，转速46m/s,时间为20s,然后置于冰上10s,此步骤重复两次，然后离心取上清。反复冻融法（简称F）：样品中加入抽提液，放置液氮中2min，然后迅速放置60℃水浴5min，此步骤重复3次，然后离心取上清。超声波破碎法（简称U）：样品中加入抽提液后，放置超声波破碎仪中，功率100w，破碎时间为5min，然后放置冰浴2min，此步骤重复两次，然后离心取上清。液氮研磨法（简称N）：先将样品中加入适量液氮快速研磨，后加入抽提液，反复颠倒数次，然后离心取上清。1.2.2ctab提取液见表1，与物理方法相结合，对于第1、10、19、28方法，加900μLSDS提取液（100mMNaCl,500mMTrispH8.0,10%SDS），对于第5、14、23、32方法，加900μLCTAB提取液（100mMTris-HClpH8.0,100mMEDTApH8.0,100mM磷酸钠pH8.0,1.5MNaCl,1%CTAB），对于第9、18、27、36方法，加900μL4MGTC提取液；对于第2、11、20、29方法，加600μLSDS,300μL饱和酚（pH8.0）；对于第3、12、21、30方法，加600μLSDS,300μL氯仿；对于第6、15、24、33方法，加600μLCTAB,300μL饱和酚（pH8.0）；对于第7、16、25、34方法，加600μLCTAB,300μL氯仿。以上各方法均是在样品中加提取液后，进行物理方法破碎处理瘤胃微生物细胞。1.2.3ph8.0,5.32,26.32先在样品中加450μL溶液A(150mMNaCl,100mMEDTAPh8.0,15mg/mL溶菌酶），放置37℃水浴，2h进行前处理，之后见表1，对于第4、13、22、31方法，加450μLSDS，对于第8、17、26、35方法，加450μLCTAB抽提液，然后再采用物理方法进行处理。1.3-等体积酚-样品将上述物理方法与化学方法处理后的样品离心，6000转/min，离心5min，取上清，加2mg/mL蛋白酶K100μL,65℃水浴，30min～1h，然后再加等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提两次，12000g,4℃离心2min。取上清加2倍冷乙醇，沉淀1h,16000g,4℃离心10min，弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀，晾干，用TE(pH8.0，含10mg/μLRNase）溶解，放置37℃水浴30min。酚和氯仿抽提一次，12000g,4℃离心2min。上清加2倍体积乙醇，过夜。16000g,4℃离心10min，弃上清。70%乙醇洗涤沉淀，晾干，溶于TE(pH8.0）。1.4dns样品的纯度DNA样品用泛基诺公司的普通型DNA纯化试剂盒纯化，样品在-20℃保存。1.5d-浓度和电泳试验用紫外分光光度计于260、280nm波长下测定粗提DNA与纯化后DNA吸光值及浓度，计算出A1.6pcr扩增条件PCR反应体系为25μL，模板为2μL。通用细菌引物：F275’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’与R14925’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’进行扩增。PCR反应参数：94℃3min,94℃40s,54℃50s,72℃2min,35循环；72℃10min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。2结果与分析2.1纯度和浓度检测结果见表2由表2可以看出，粗提的DNA的OD2.2瘤胃微生物基因组dna片段分子量图1、2、3、4分别为珠磨法、反复冻融法、液氮研磨法、超声波法，且在这4种物理方法中采用不同化学提取液提取DNA的电泳图。对不同方法提取的DNA样品进行电泳检测，上样量均为8μl。图1、2、3、4均显示瘤胃微生物DNA片段分子量在20kb左右，表明已获得较大片段的瘤胃微生物基因组DNA。由图1可以看出，在珠磨法中，加入CTAB提取液得到的DNA的量明显高于其它提取液，而且在加入CTAB提取液后，将样品放置65℃水浴几分钟，提取DNA的效果会更好选取珠磨法和反复冻融法中部分样品，经过纯化后电泳，从图5中可以明显看出，纯化后的DNA结果较理想，条带明亮，说明可用于以后的分子生物学操作。2.3粗提dna的纯化以不同方法提取DNA纯化处理后作为模板，可得到PCR反应产物。从图6中可看出，不同方法粗提的DNA纯化后作为模板，得到的PCR产物量不同。以珠磨法加CTAB提取液的方法得到的最多，而液氮研磨法与超声波法得到的产物的量较少。3玻璃珠和反复冻融法提取环境微生物的最佳条件选择从以上方法提取的效果来看，珠磨法与反复冻融法结合相应的化学提取液，可以获得比较完整的瘤胃微生物总DNA，并且效果要比液氮研磨法和超声波法好。在珠磨法中，选用直径为150μm的玻璃珠提取效果最佳，但是震荡的时间不宜过长，频率不宜太高，如果时间过长，震荡幅度过大，有可能将大片段的DNA断裂，增加DNA的断片。反复冻融法在提取环境微生物及海洋微生