骨髓间充质干细胞在心血管疾病中的应用

骨髓间充质干细胞在心血管疾病中的应用

广东医学院（广东省江州52403）。心血管系统疾病已成为现代社会严重影响人类健康的重大疾病。在心血管系统疾病中,慢性心功能不全和心肌梗死是最为严重的两种疾病,其特征是心肌细胞死亡导致细胞数量减少和心肌功能低下,由于心肌细胞通常被认为是终末分化的细胞,心肌细胞死亡就意味着心肌细胞数量的减少,因此植入适宜的外源性细胞,增加梗死区心肌细胞数量,将是修复或重建心脏功能、具有潜在临床应用价值的方法。骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织含量最为丰富,在一定的条件下能向心肌细胞转化。随着研究的深入,MSCs分化为心肌细胞的潜能越来越受到人们的关注,运用MSCs作为心肌移植的种子细胞治疗心血管疾病成为医学研究领域的前沿和热点。MSCs分化为心肌细胞受多种因素的影响,本文就MSCs分化为心肌细胞的调控机制及其微环境研究进展综述如下。1-氮杂胞苷诱导mscs向心肌细胞分化的细胞序列1999年,MAKINO等证实MSCs在5-氮杂胞苷的诱导下可分化为心肌细胞,分化率约为30%,该研究组从小鼠骨髓基质细胞分离出心肌细胞系(cardiomyogeniccellline,CMG),用3μmol/L的5-氮杂胞苷处理,诱导前的CMG表达Nkx2.5/Csx,GATA4,TEF-1和MEF-2CmRNA,诱导后的CMG不仅细胞形态发生改变,细胞间通过闰盘连接形成肌管状结构,免疫组化显示ANP、BNP、actin和desmin阳性,RT-PCR或Northernblot分析心肌特异基因的表达,结果显示分化后的MSCs表达ANP、BNP、α-MHC、β-MHC、α-MHC等心肌特异性基因,同时用RT-PCR-Southernblot分析,表达Nkx2.5/Csx,GATA4,TEF-1,MEF-2CmRNA,MEF-2A,MEF-2D等心肌细胞特异性转录子,值得注意的是,β-MHC表达的量远远高于α-MHC,β-MHC是胎儿或新生儿心室肌的主要成分。韦育林等的研究也显示,5-氮杂胞苷诱导后的MSCs,细胞体积比诱导前增大,更加细长,呈长梭型,细胞间出现连接,排列方向渐趋一致,形态上向心肌细胞接近,免疫组化分析显示诱导分化后的部分MSCs细胞desmin、α-sarcomericactin和心肌特异性cTnI呈阳性反应,提示诱导分化后的MSCs不仅有肌样细胞的共同特征,而且有心肌细胞的特征,从蛋白水平证实MSCs经5-氮杂胞苷诱导可向心肌细胞分化,RT-PCR结果显示诱导后的MSCs表达β-MHC,从而在基因水平上证实5-氮杂胞苷诱导MSCs向心肌细胞分化。TOKCAERKESKIN等在研究5-氮杂胞苷体外诱导MSCs分化为心肌细胞时发现,分离培养的MSCs在第9天和第14天用5-氮杂胞苷诱导分化后,与对照组相比,高表达心肌特异性标志物,如troponinⅠ,α-sarcomericactin,MEF-2D,该研究结果为MSCs体外诱导分化培养的时效性提供实验依据。早期的体内分化研究认为,MSCs可在体内分化为心肌细胞。但有学者认为MSCs移植入宿主心脏后,并非是分化为心肌细胞,而是与体内原有的宿主心肌细胞融合的结果。近来,研究工作者设计了更全面的实验,证实MSCs在体内确实能向心肌细胞分化。TOMA等用lacZ标记hMSC,注入CB17/SCID成年小鼠左心室,一个星期后,免疫组化显示,标记lacZ的hMSC表达desmin,β-MHC,α-actin,cTnI等心肌特异标志物。随后,TANG等通过结扎小鼠左冠状动脉建立心肌梗死模型,然后注入DAPI标记的小鼠MSCs到梗死心肌附近区域,4周后免疫组织化学染色,荧光显微镜分析发现,DAPI标记的MSCs表现cTnI阳性,供体细胞心肌化,证明MSCs在体内可分化为心肌细胞。这种采用遗传或化学标记的MSCs移植,能够在宿主心肌组织中寻找到供体来源的证据,并且这些供体来源的细胞能表达心肌细胞特异性标志物,证实MSCs确实能在体内分化为心肌细胞。2细胞-细胞的直接接触对mscs分化的诱导作用微环境在胚胎发生和器官形成中起重要作用,局部微环境的信号是决定干细胞分化的重要因素,而细胞之间的crosstalk可能调节这一进程。近年来有越来越多的研究表明心肌微环境是诱导MSCs定向分化为心肌细胞的天然诱导剂。虽然其分化机制尚不确切,但可以肯定的是MSCs所处的微环境对MSCs分化所起的决定性作用,如果将MSCs移植到心肌瘢痕组织中去,MSCs则分化为非心肌细胞。心肌微环境存在的细胞因子以及MSCs在分化过程中旁分泌产生的可溶性物质,如转化生长因子(transforminggrowthfactorβ,TGF-β)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)、干细胞因子(stemcellsfactor,SCF)、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor,G-CSF)、骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)等,构成了干细胞生长微环境的信号物质,共同调节MSCs的增殖和分化。但是,这些细胞因子必须在心肌微环境下才能发挥其促分化作用,单独存在并不能使MSCs分化为心肌细胞。梗死心肌血清含有的各种炎症因子,如IL-1、IL-10、TNF-α等,一般认为,血清中的这些炎症因子在MSCs向心肌细胞分化过程中起重要的诱导作用。陈运贤等研究表明,AMI血清及同类血清能促进MSCs向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟,但单独用AMI血清诱导MSCs,未见有心肌样细胞改变,提示,血清中的炎症因子单独并不能诱导MSCs向心肌细胞分化,只有在5-氮杂胞苷或心肌微环境的共同作用下才能使MSCs向心肌细胞方向分化。WANG等将MSCs置于3种不同的培养基中培养:与心肌细胞直接共同培养、与心肌细胞间接共同培养(两种细胞不直接接触)、用心肌细胞条件培养液培养,结果发现,在这三种不同的培养条件下,只有与心肌细胞直接接触培养的MSCs可表达心肌细胞的标志物α-actin、desmin和cTnT,其它两种培养条件下的MSCs则不表达α-actin、desmin和cTnT,该研究结果说明,细胞-细胞之间的直接接触可诱导MSCs分化为心肌细胞。为了探明究竟是细胞间的物理接触还是可溶性化学因子在MSCs的分化过程中起决定性作用,他们用半透膜培养系统(只允许化学因子扩散,而细胞不能扩散)将心肌细胞和MSCs共同培养,结果MSCs不表达α-actin、desmin和cTnT,说明心肌细胞释放的可溶性化学因子单独存在时不足以诱导MSCs的分化,MSCs和心肌细胞的直接接触是必须的。FUKUHARA等也证明,细胞-细胞的直接接触在MSCs分化为心肌细胞中起着非常重要的作用。基于这些研究结果分析,成熟的心肌细胞可能含有某些诱导干细胞分化的化学因子,这些化学因子通过与心肌细胞的连接被移植的细胞摄取,而不能被心肌细胞直接分泌到细胞外间隙,但当心肌细胞裂解后这些化学因子被释放,且参与心肌微环境的形成,从而诱导移植细胞的分化。细胞间相互接触牵张感受器对机械性牵拉作用引起细胞形态的改变,直接接触的细胞和细胞基质所提供的跨膜信号刺激启动细胞间的信号转导途径,细胞之间的电生理环境等,都可能是细胞-细胞直接接触诱导MSCs分化的机制。然而,有学者持相反的观点,LI等通过半透膜共培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞和新生大鼠心肌细胞(两种细胞不直接接触),发现有的间充质干细胞开始搏动,通过免疫组化、RT-PCR、电生理、透射电镜等检测,这些细胞有心肌细胞的特征。尽管有不同的观点,但绝大多数学者认为,细胞-细胞的直接接触在MSCs分化为心肌细胞起重要的作用。3体外心功能特性及体外光谱早在1999年,MAKINO等在体外应用5-氮杂胞苷将骨髓来源间充质干细胞诱导分化为心肌细胞。5-氮杂胞苷是胞苷类似物,是一种化疗药物,可以通过非竞争性抑制DNA甲基化酶使基因去甲基化,而DNA去甲基化可以引起基因激活和表达从而使细胞分化。在MSCs基因序列中包含一个甲基化区域决定肌转化,一般状态下,该区域处于转录失活状态,多数学者认为可能是由于5-氮杂胞苷和控制向心肌分化的特异启动子基因上阻遏蛋白结合,使其去甲基化而发生构型改变,从而启动细胞向心肌细胞分化,使MSCs转化为心肌细胞。有研究表明MSCs在用5-氮杂胞苷诱导一周后有MyoD1基因的表达,而此种基因被认为是祖细胞分化为肌细胞的始动性启动因子。研究表明,多种信号途径参与调控脊椎动物心脏的发生,包括BMP、Wnt、Notch、FGF四条信号转导途径。已发现有多条信号途径参与了MSCs的增殖和分化,如Wnt途径、Notch途径、BMP途径、FGF途径、MAPK途径等。BMP属于TGF-β蛋白家族成员,通过Smad、MAPK和JNK的激活而参与信号转导通路。BMP信号途径参与MSCs分化为心肌细胞主要是通过BMP2/BMP4与受体结合后激活其下游基因Nkx2.5和GATA4,GATA4是心肌亚家族的成员,心肌细胞特异转录因子,能调控心脏肌球蛋白重链、心肌肌钙蛋白、ANP等的表达,Nkx2.5/csx和GATA-4主要地表达在心肌细胞和心肌祖细胞,单独激活Nkx2.5/csx或GATA-4不能向心肌细胞分化。MONZEN等研究发现,在P19CL6心肌细胞系(CMG)向心肌细胞分化过程中,BMP是必不可少的信号分子,通过TAK1-MKK3/6-P38/JNK和Smad两条途径转导信号发挥作用,实验证明BMP通过Smad和TAK1两条途径协同激活ATF-2,从而转录激活心肌特异基因表达,使CMG向心肌细胞分化。ATF-2是Smad和TAK1的共同核心靶点,在TGF-β信号途径中起中心作用,参与Smad和TAK1途径的下游通路。为了证明ATF-2在CMG向心肌细胞分化中的重要作用,转染ATF-2突变体到P19CL6,过表达ATF-2阴性的ATF-2抑制GATA-4,MEF2c,MLC2V等mRNA的表达,以及抑制β-MHC,ANP,BNP等基因启动子的激活。不难推测,间充质干细胞向心肌细胞分化的BMP信号途径,与上述途径肯定有很多相同之处。Notch标志最原始、多向分化潜能的细胞,Notch信号通路可能对干细胞未分化状态的维持十分重要,通过胞内区与胞浆和胞核内的相关蛋白结合来抑制分化相关基因的转录,最终达到抑制细胞分化的目的。NEMIR等发现Notch信号途径在小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞和心肌的形成具有重要的作用。LI等研究表明,Notch1高表达于MSCs细胞表面,Notch的受体蛋白jagged1激活Notch信号途径,提高MSC向心肌细胞分化的分化率,当加入Notch信号途径阻断剂DAPT后,其分化率明显降低。MSCs可表达Wnt途径的不同成员,如Wnt的配体:Wnt2、Wnt4、Wnt5a、Wnt11、Wnt16,受体:Fz2、Fz3、Fz4、Fz5、Fz6和DKK1。Wnt信号与胚胎时期肌形成和出生后肌再生有关,Wnt1/3a基因敲除的小鼠胚胎显示肌形成缺陷。Wnt/β-catenin途径在MSC分化为骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞是必不可少的,提示,Wnt可能在MSCs分化为心肌细胞发挥重要作用。sFRP家族蛋白可直接与Wnts结合,从而阻止其与相关受体的结合,抑制Wnt信号途径。ALFARO等研究发现,sFRP2可增强MSCs在梗死心肌处的植入,肉芽组织的形成,以及心肌的修复,通过基因组功能分析,MSCs细胞的sFRP2明显上调,从而抑制Wnt经典途径。Wnts可以结合多种Fz受体,而每一个受体又可以结合多种Wnt,Wnt/Fz的形式可多种多样,MSCs表面的Wnt在细胞内特异的激活途径,对我们充分理解MSCs分化的信号机制有重要作用。多条信号途径参与了MSCs向心肌细胞的分化,每条途径精确的调控机制,以及它们之间可能存在的crosstalk,如TGF-β/BMP和Wnt协同刺激MSCs的增殖,抑制它们的分化,而TGF-β/BMP和Notch既可以协同地调节它们共同的靶基因,功能上又可以表现为相互拮抗作用,在10T1/2成纤维细胞分化为平滑肌样细胞过程中可观察到Notch3和TGF-β/BMP之间的相互抑制。这些信号途径形成复杂的网络究竟如何精确地调控MSCs分化为心肌细胞,有待进一步的深入研究。2006年,YE等用二维电泳和质谱分析方法研究在5-氮杂胞苷诱导下,大鼠和猪的MSCs分化为心肌细胞前后蛋白质谱表达的变化,在来源于大鼠的MSCs实验中,成功鉴定了34种蛋白质,其中9种蛋白质在5-氮杂胞苷诱导后发生显著的变化,这些蛋白质包括细胞骨架蛋白,钙结合蛋白,代谢蛋白等,可通过不同的信号转导途径参与细胞的增殖和分化,而在来源于猪的MSCs实验中,用二维电泳分离出1700种蛋白质,通过与对照组比较,5-氮杂胞苷诱导后的MSCs,有11种蛋白质表达上调,26种蛋白质表达下调,其中的一些蛋白,如HSP27,α-B晶体蛋白,AnnexinA2,Stathmin1同样是通过不同的信号传导途径参与了细胞的增殖和分化。值得关注的是,HSP27是参与调节肌动蛋白丝动力学信号途径的一种蛋白,同时也是大鼠胚胎干细胞分化必需的蛋白,提示HSP27可能在心肌细胞形成过程中起重要作用。AKAVIA等用Affy