肺腺癌中ros1和re基因的研究进展

肺腺癌中ros1和re基因的研究进展

最近，肺肿瘤基因组学显示了一些重要基因位置的遗传变化。在肺腺癌细胞中,这些遗传变异参与诱导增殖、转移扩散以及抑制细胞凋亡。几乎所有的驱动突变都相互排斥,因此被称为肺腺癌分子亚型。在不同分子亚型中,这些驱动基因突变使特异性抑制剂成为潜在治疗靶点。以表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)突变和间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(anaplasticlymphomareceptortyrosinekinase,ALK)基因重排为靶点的治疗药物(厄洛替尼、吉非替尼和克唑替尼)已经成功应用于临床常规治疗。在这些分子亚型中,与标准的化学治疗(化疗)相比,针对这些特殊靶点的治疗在反应率(responserate,RR)、无疾病进展生存时间(progressionfreesurvival,PFS)以及总生存时间(overallsurvival,OS)上有明显改善,第一次突破了已持续数十年之久的化学治疗晚期腺癌中位总体生存期小于1年的治疗瓶颈。遗憾的是,迄今为止虽然已经发现50%以上肺腺癌的驱动基因,但只有包括EGFR和ALK突变在内的15%患者能够从临床个体化治疗中获益,而其他患者或是驱动突变基因未知,或是暂时没有针对驱动突变基因的特异性治疗。最近3%肺腺癌患者发现了两个新受体酪氨酸激酶基因重排序列。基于此,针对肺癌的有效个体化治疗方案范围将可能迅速扩大。2012年4个独立的研究小组首次报道有1%肺腺癌患者发生RET基因重排。初步研究表明,RET基因重排的肺癌细胞系对RET激酶抑制剂(如凡德他尼)敏感。肺腺癌中ROS1基因重排最早发现于2007年。2012年一项大型的肺腺癌队列研究(n=1073)显示ROS1基因重排发生率为2%。此外,克唑替尼治疗ROS1基因重排患者的I期临床试验的初步结果令人可喜。两种激酶的重排导致激酶结构域与不同的配体结合并介导形成同型二聚体,这也是基因融合蛋白的致癌原因。本篇就RET和ROS1激酶及其在细胞中的生理作用,尤其是作为肺腺癌肿瘤驱动基因的功能作一综述。此外,我们还将概述当前RET和ROS1激酶抑制剂及其临床试验。1ret基因融合及功能RET原癌基因在1985年首次发现于NIH-3T3细胞模型,其通过DNA重排而激活。RET基因位于10号染色体长臂11.2区域,包含21个外显子。它编码一种受体酪氨酸激酶,包括胞外结构域(含有四个钙黏蛋白样重复序列、一个钙结合位点和一个富含半胱氨酸的区域)、跨膜区和胞内结构域。其通过选择性剪切羧基末端胞质尾区形成3种常见的亚型:长型(RET51)、中等型(RET43)、短型(RET9)。它们以后面跟随的氨基酸分歧点的数量来命名。RET51和RET9是最具特征的分子亚型。RET蛋白的主要配体属于胶质源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)家族,包括GDNF、青蒿琥酯、neurturin和persephin。RET受体是细胞表面复合物的一部分,它与GDNF家族受体α的共受体连接,从而与GDNF家族成员结合。RET受体与配体结合后,通过形成RET-同型二聚体而激活激酶结构域,导致胞内结构域自身磷酸化。RET蛋白的激活可激活多个下游信号通路,包括丝裂原活化蛋白激酶(Ras/Raf/extracellular-signal-regulatedkinase,RAS/RAF/ERK),磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphoinositide-3-kinase/serinethreoninekinase,PI3K/Akt)和Jun氨基末端激酶(JunN-terminalkinase,JNK)通路。RET在中枢和周围神经系统的神经细胞亚群、沃尔夫管、新生输尿管、输尿管和精原细胞中表达。RET激酶缺失的小鼠出生时可存活,但可因肾发育异常或发育不全而在一天之内死亡。这类小鼠也不能发育形成完整的肠道神经丛,与RET基因功能缺失突变导致Hirschprung病的发生相符。RET基因与人类癌症之间的首次联系是基于甲状腺乳头状癌(papillarythyroidcarcinoma,PTC)中RET基因体细胞重排的发现。这些重排序列导致了酪氨酸激酶的组成性激活。RET基因重排可存在于30%散发的和70%辐射诱导的乳头状甲状腺癌中。迄今已发现12个不同的RET基因5’端融合配体基因。RET的生殖细胞活化点突变与多发性内分泌腺瘤病2型(multipleendocrineneoplasia2,MEN2)综合征相关。MEN2综合征分为3个不同的表型:MEN2A[甲状腺髓样癌(medullarythyroidcancer,MTC)、嗜铬细胞瘤(chromaffincarcinoma,PC)和甲状旁腺功能亢进症]、MEN2B(MTC和PC)和家族性甲状腺髓样癌(familialmedullarythyroidcancer,FMTC)。每个表型都与RET基因特定的突变位点相关。RET基因体细胞突变也与50%的散发性甲状腺髓样癌相关。2ret基因融合基因2012年4个独立的研究小组发现在非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)中存在一种与RET激酶结构域相关的新的重排突变。这些研究组共筛查了2650个肺癌患者,显示RET突变的频率为1%。RET在正常肺组织中的表达非常低,当有RET融合基因存在的情况下表达量明显增高。KIF5B-RET融合基因的转化能力在Ba/F3细胞系的临床前基础研究中表现为表达融合蛋白后,Ba/F3细胞可不依赖白介素-3生长;在NIH3T3细胞系中表现为表达RET融合蛋白后,该细胞系可出现锚定非依赖性的细胞增殖。人工细胞系统显示出对多种激酶抑制剂凡德他尼、舒尼替尼和索拉菲尼治疗敏感,这些抑制剂能够抑制RET激酶活性。目前的数据表明,在NSCLC中RET基因重排与其他已知的驱动突变互斥,进一步支持RET在NSCLC中扮演驱动致癌基因的角色[9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22]。最常见的RET基因融合蛋白是由KIF5B基因的前15个外显子和RET基因的第12~20个外显子组成。KIF5B的第1~15外显子包含一个驱动蛋白马达和卷曲螺旋结构域,能够介导融合蛋白二聚化。KIF5B的第15号外显子融合位点也存在于NSCLC的KIF58-ALK融合蛋白中。RET基因的12~20号外显子包含RET激酶结构域,能够激活下游激酶信号通路、PI3K/Akt和/或RAS/MAPK通路。目前,已发现KIF5B-RET融合基因的7个异构体和KIF5B之外的两个融合基因,即CCDC6基因和NCOA4基因(核受体辅助因子4)。在PTC中,CCDC6与NCOA4曾分别作为RET/PTC1和RET/PTC3而被描述过。它们都含有卷曲螺旋结构域,能够介导癌基因蛋白的二聚体化。Wang等筛查了936例NSCLC,发现13例患者RET基因融合阳性(1.4%),并研究了RET融合基因患者与其临床病理特征之间的关系。他们提出RET融合阳性患者的临床病理特征应包括:年轻(≤60岁)、非吸烟、早期淋巴结转移、肿瘤分化差、实体瘤为主亚型。融合基因可以用RT-PCR,荧光原位杂交(fluorescentinsituhybridization,FISH)和免疫组织化学(免疫组化)的方法来测定。在NSCLC中,与FISH法相比,用免疫组化方法检测ALK易位的敏感性为90%,特异性为97.8%。然而,目前免疫组化法尚未被确定可用于RET基因的检测,故而尚不能在临床试验中用于筛选NSCLC中的RET融合基因。FISH虽然耗费成本与人力,但仍然是检测NSCLCRET融合基因的金标准(图1)。此外,RT-PCR检测可能会漏诊新的融合基因。然而,考虑到必须对肺癌的多个驱动突变同时进行治疗前评估,相信在不久的将来,基于多基因测序的新一代测序将取代不同的单基因(包括RET)检测的方式。3抗ret酪氨酸激酶抑制剂的临床试验迄今为止,还没有开展RET抑制剂治疗含有RET基因融合的NSCLC的临床试验。既然RET基因融合和激活突变存在于分化型甲状腺癌(differentiatedthyroidcarcinoma,DTC)和甲状腺髓样癌(medullarythyroidcarcinoma,MTC)中,我们首先概述抗RET活性的酪氨酸激酶抑制剂治疗DTC和MTC患者的临床试验。然而,由于甲状腺癌的RET基因突变和RET基因融合频谱与目前已知的NSCLC中的RET不同,这些临床试验数据还不足以使我们对NSCLC中RET抑制剂作用有足够的认识。甲状腺癌RET基因特异突变可对应于特定的疾病亚群。RET融合最常见于PTC中,与NSCLC中融合类似。临床前研究表明在甲状腺癌中不同的酪氨酸激酶抑制剂抗多种RET突变亚型时具有不同的活性。例如,在含有RET-PTC1融合基因的细胞系中,cabozantinib与凡德他尼相比效果更佳,而NSCLC中也存在该融合基因。在设计肺癌的抗RET酪氨酸激酶抑制剂临床试验时,可借鉴这些研究结果。抗RET酪氨酸激酶抑制剂在NSCLC中已经做评估,但并不是针对RET融合基因患者。因此,这些试验并没有提供更多其在RET阳性肺癌患者使用的有效信息,况且这些临床试验(凡德他尼、舒尼替尼、索拉菲尼)都不是特异性的RET抑制剂,而是多靶点抑制剂。这使得对甲状腺癌中RET抑制作用的理解更为复杂。表1中列举了具有抗RET活性的多靶点激酶抑制剂。3.1mtr-pcr的临床疗效凡德他尼是一种RET,VEGF2,VEGF3和EGF受体酪氨酸激酶抑制剂,基于一项关于凡德他尼治疗遗传性MTC公开的单臂II期试验结果,2011年4月美国FDA批准了凡德他尼用于治疗不能手术而又有进展或症状的转移性MTC患者。这项II期试验证实:在进行第一次评估时,83%的患者在接受凡德他尼治疗后肿瘤缩小,30例患者中有11例患者的初次肿瘤病灶缩小≥30%,6例患者按RECIST标准划分被证实为部分缓解(partialremission,PR);24周的疾病控制率为78%,在被证实为PR的患者中,中位持续有效时间为10.2个月。继II期临床试验之后,一项大规模的III期临床试验显示:与安慰剂相比,凡德他尼在治疗散发性、家族遗传的MTC时疗效显著改善,患者的PFS明显延长,危险比(HR)为0.46(95%CI0.31~0.69,P<0.001)。临床前研究提示:在MEN2B细胞系中,与cabozantinib相比,凡德他尼活性更佳。MEN2B中的主要突变是位于RET激酶结构域激活的M918T点突变,这也是散发型MTC中最为常见的突变。在体内、体外实验中,凡德他尼也表现出具有抗RET/PCT的活性。3.2mtc患者的疗效Cabozantinib是RET,VEGFR2和MET酪氨酸激酶的强效抑制剂,于2012年11月被美国FDA批准用于MTC的治疗。早期的MTC信号通路在I期剂量递增试验中得到验证,随后在MCT患者中一个扩大样本的I期试验也验证了cabozantinib的作用。在纳入该试验的35名具有可测量病灶的MTC患者中,17例(49%)患者在第一次评估时,肿瘤直径缩小不低于30%。68%的患者疾病稳定期在6个月以上。其后的一项III期试验以安慰剂为对照,评估cabozantinib治疗进展的、不可切除的、局部晚期或转移的MTC患者的疗效。第一组数据是在2012年美国临床肿瘤学会(AmericanSocietyofClinicalOncology,ASCO)年会中呈现的,已经实现了主要的观察目标,即患者的PFS显著延长(HR0.28,95%CI0.19~0.40,P<0.0001)。2012年7月的一项II期试验(NCT01639508)在斯隆-凯特琳癌症纪念中心开展,旨在检测cabozantinib在KIF5B/RET阳性NSCLC中的疗效。这是探索该新定义NSCLC亚群的个体化治疗的第一个研究。有趣的是,在含有RET-PTC1融合基因细胞系的体外研究中,cabozantinib效果较凡德他尼更好,RET-PTC1融合基因亦存在于NSCLC中。3.3iii期临床应用索拉菲尼是一种针对VEGFR1,VEGFR2,KIT,RET,BRAF和CRAF的多靶点酪氨酸激酶抑制剂。在体外实验中,低纳摩尔浓度的索拉菲尼可以抑制RET基因,在RET驱动的移植瘤中具有抗肿瘤活性。一些II期临床试验中也检测了索拉菲尼在DTC,甲状腺未分化癌和MTC患者中的作用。在一项纳入41例PTC患者的开放临床II期试验中,6例患者为PR,23例患者的疾病稳定期持续6个月以上;这些患者PR的中位持续时间是7.5个月。作者认为在转移性PTC中索拉菲尼是一种有效的治疗药物。该试验包含基因型检测,大部分PTC患者带有BRAF激活突变,却无一例表现为RET/PTC1或RET/PTC3突变阳性。这些观察结果给索拉菲尼在RET驱动的NLSLC中的应用带来了困难。在另一项II期临床试验中,再次验证了索拉菲尼在局部晚期或者转移性MTC患者中的作用。在15例可评估的散发性的MTC患者中,1例患者达到了PR,超过50%的患者病情稳定≥15个月。大部分的受试患者中含有RET基因激活突变。来自古布塔艾伯拉姆森等研究机构的II期试验显示:在30例(其中27例患者为DTC)转移、非碘依赖性的甲状腺癌患者中,PR比例为23%(7/30)。中位PFS为19.75个月。在这篇文献中没有提供特定的基因型检测的数据。鉴于23%的PR以及19.25个月的中位PFS,在这些患者中采用索拉菲尼治疗的效果可能会优于化疗。3.4疾病稳定性评估舒尼替尼是一种针对VEGFR,Flt-3,c-Kit和RET基因的多靶点酪氨酸激酶抑制剂,体内和体外实验中已证实是有效的RET-PTC癌蛋白抑制剂。在一项纳入了33例可评估的非碘依赖DTC和MTC患者的II期试验中,1例患者达到疾病完全缓解(completeremission,CR),10例达到PR,16例为疾病稳定。18F脱氧葡萄糖-正电子断层扫描(18fluorodeoxyglucosepositronemissiontomography,18FDG-PET)摄取的降低与实体瘤疗效评价标准(responseevaluationcriteriainsolidtumours,RECIST)反应之间亦存在显著相关性。2008年ASCO会议中展示了两项评估舒尼替尼治疗甲状腺癌研究的中期结果。Cohen等的研究表明,在31例具有可测量病灶的DTC患者中,应用至少2个周期的舒尼替尼后,13%的患者达到PR,65%的患者达到疾病稳定。在MTC患者中,没有患者达到PR,但85%的患者达到疾病稳定。在一组含有MTC,DTC和甲状腺未分化癌的患者队列中,Ravaud等发现在15例可评估的患者中,1例PR,12例疾病稳定。另外还发表了两篇个案报道:其中一篇报道舒尼替尼治疗1例MTC患者时达到PR;另外一篇为关于舒尼替尼治疗一例PTC患者的报道。3.5motscib对ret基因突变的污血压多靶点酪氨酸激酶抑制剂motesanib抑制VEGFR,PDGFR,Kit和RET基因,而且已在表达RETC634W蛋白的TT肿瘤细胞移植瘤模型中显示出了抗肿瘤活性。但是也有研究提示motesanib对RET突变的C634W无效,仅在野生型RET中有效。一项motesanibII期实验研究纳入了93例已被证实的局部晚期伴转移的DTC或MTC患者,其中PR率为14%,SD率为68%。但是在这些患者中,无一例经基因型检测证实为RET基因突变或是RET基因重排。另一项评估motesanib的II期实验纳入了91名患者,在这项研究中,仅有2%的患者达到PR,81%的患者达到SD。RET突变阴性(n=10)和阳性(n=28)亚组的客观有效率分别为10%和0%。4ros1和h3细胞间质相互作用的机制:细胞内激酶抑制剂的联合ROS被发现于1982年,是鸟类肉瘤RNA肿瘤病毒UR2(曼彻斯特大学肿瘤病毒2)的致癌基因的产物。同年,v-ROS1被认定为是UR2中特有的致癌基因序列。在UR2病毒中,v-ROS1与gag基因融合,融合基因gag-ros的产物经鉴定具有酪氨酸激酶活性。1984年发现与c-ROS1基因类似的mf3基因,能诱导NIH3T3细胞系的恶变。ROS1(vROS鸟类UR2肉瘤病毒致癌基因同源物1)位于6号染色体长臂16-22区。该区域与包括胶质母细胞瘤、肝小胆管癌和肺腺癌在内的不同的恶性肿瘤中非随机染色体重排相关。ROS1受体酪氨酸激酶包含了一个胞外结构域、一个疏水性跨膜区和一个胞内激酶结构域。ROS是一个与ALK基因和胰岛素受体家族相关的独特的受体。ROS1的胞外部分包含了一个YWTD螺旋桨域,该区域可以折叠成三螺旋结构域和9个III型纤连蛋白结构域。尽管ROS1有一个大的胞外结构域,但迄今还没发现其配体。纤连蛋白III结构域的出现是细胞黏附分子(cellularadhesionmolecule,CAM)的一个共同特点,因此ROS1胞外区纤连蛋白III结构域的联合是与细胞内激酶活性相偶联的,可能是黏附衔接转化为细胞内信号通路的直接路径。尽管MEK抑制剂PD98059没有能够抑制鸡胚成纤维细胞或者是NIH3T3细胞中EGFR-ROS嵌合体的转化能力,但通过激活ROS1确实可激活众多下游信号通路,包括信号转导和转录激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription3,STAT3),PI3K/AKT和RAS/MAPK/MEK通路。ROS1在小鼠、大鼠和鸡的肾和肠道中表达。在小鼠中,c-ROS的表达似乎在肾的发育,尤其是上皮-间质相互作用时期扮演了重要角色。成年小鼠发育成熟的肾中c-ROS表达量很低。小鼠睾丸中可检测到c-ROS的表达,但仅限于附睾头部的上皮细胞中。ROS对附睾头上皮细胞成熟的重要作用已经在ROS缺乏的小鼠模型中得到验证。这些缺乏ROS基因的小鼠由于精子功能的缺陷导致失去繁殖能力,这可能是因为促进精母细胞成熟的功能性附睾的获能不当。c-ROS敲除的小鼠除了不育,其他方面都很健康。在人类附睾中也可检测到c-ROS,尽管与其在小鼠中表达的空间分布不同。同时也可在人体肺、胎盘和骨骼肌组织等其他组织中检测到c-ROS的表达。人类癌症和ROS1之间的关联始于1987年,基于胶质母细胞瘤细胞系中存在ROS1相关的体细胞重排,尽管当时并没有发现ROS1的配体。Charest等在2003年阐述了ROS1与胶质母细胞瘤保险丝(gliobastomafuse,FIG)基因的融合。FIG-ROS1融合蛋白是通过一个染色体内部的小片段缺失形成的,是第一个受体酪氨酸激酶融合蛋白,该受体酪氨酸激酶不是由基因易位或倒置而形成。而且,FIG-ROS融合蛋白不仅能够在体外转化NIH3T3细胞系,而且能够促进免疫功能缺陷的裸鼠形成肿瘤。在体内实验中,FIG-ROS融合蛋白在中枢神经系统内的表达可以诱导胶质母细胞瘤的形成。FIG-ROS融合蛋白在胆管癌细胞系和来自患者的肿瘤标本中也有表达。5cd49-ros1融合基因的融合Rikova等在2007年首次描述了NSCLC中的ROS1基因重排(图1)。他们在41个NSCLC细胞系和150个NSCLC肿瘤标本的磷酸化蛋白质组学筛查中发现了2种ROS1基因融合(SLC34A2-ROS1和CD74-ROS1)。SLC34A2-ROS1是在HCC78细胞系中发现的。SLC34A2是溶质载体家族的一部分,在肺、乳腺、睾丸和肝等器官中均有表达。SLC34A2的基因表达产物NaPi-IIb蛋白参与了肺泡表面活性剂中Pi的重吸收。NaPi-IIb蛋白是一种8次穿膜蛋白。SLC34A2基因突变能破坏正常的蛋白功能,其与肺泡微石症也有关。融合基因存在2种变异体:SLC34A2的4号外显子与ROS的32号外显子融合或者是SLC34A2的4号外显子与ROS的34号外显子融合。在这两种情况下,融合基因均表达为一种具有两个跨膜结构域的蛋白。在一名非吸烟的女性腺癌患者中发现了CD74-ROS1基因融合,该肿瘤中CD74的6号外显子与ROS1的34号外显子融合,CD74编码了一个II型膜蛋白,这种蛋白具有巨噬细胞迁移抑制因子受体的功能,也是MHCII类分子的伴侣。SLC34A2-ROS的转化能力体现在该融合基因可导致SLC34A2-ROS反转录病毒转化的3T3细胞的非锚定依赖性生长、在裸鼠中形成肿瘤。已经在成纤维细胞以及NSCLC细胞系中验证了CD74-ROS1融合基因的致癌能力:CD74-ROS1融合基因的异位表达能够在体外诱导高侵袭性(基质胶Boyden小室侵袭实验),并且在体内诱导转移的形成。最近,为明确NSCLC中ROS1基因重排的频率,两项大型研究总共筛查了超过2000例的NSCLC患者,最终发现ROS1重排在NSCLC中的频率约为2%。ROS1基因融合患者的临床特征与ALK易位患者的临床特征非常相似。ROS1融合阳性的肿瘤患者更倾向于吸烟较少者(<10包年)或不吸烟者,且与年轻、腺癌组织学类型相关。Takeuchi等在NSCLC中发现了其他的ROS1融合配偶体:原肌球蛋白3(TPM3)、多配体蛋白聚糖4(SDC4)、富含亮氨酸重复序列和免疫蛋白样结构域(LRIG3)、埃兹蛋白(EZR)和胞质型内质网蛋白滞留受体2(KDELR2)。已知的融合蛋白中保留了ROS1基因的激酶活性,且ROS1重排与其他已知的NSCLC致癌事件如KRAS突变、EGFR突变或是ALK突变并不重叠。目前已经建立了在肺泡上皮细胞中表达EZR-ROS1融合蛋白的转基因小鼠模型,该模型可在幼年小鼠双肺内形成腺癌。6ros1基因融合抑制剂在肺癌相关病例中的作用一直以来,尽管熟知ROS1在胶质母细胞瘤中扮演癌基因的角色,但是选择性的ROS1抑制剂还没有经过临床验证。ROS1激酶与ALK具有高度的序列同源性,这主要体现在ATP结合位点中具有77%的氨基酸序列同源性,ALK激酶抑制剂的活性已经在含有ROS1融合蛋白的肿瘤和细胞系中得到检测。ALK激酶抑制剂TAE684对含有SLC34A2-ROS1融合基因的肺癌细胞系HCC78和表达FIG-ROS融合蛋白的BaF3细胞系都有作用[58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75]。克唑替尼是ALK/MET抑制剂,