2,4,6-三硝基苯磺酸诱导炎性肠病动物模型的建立

2,4,6-三硝基苯磺酸诱导炎性肠病动物模型的建立

炎症性肠病（ibd）是一种病因不明的慢性肠炎病性疾病。由于其恶劣的倾向，它对患者构成严重的威胁。这是除恶变外，对胃肠功能中最严重的疾病之一。IBD主要包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)和克罗恩病(Crohn’sdisease,CD)。其发病率在欧洲和北美最高,在亚洲等地区也呈逐年上升的态势。IBD确切的病因和发病机制尚不清楚,可能的致病因素包括环境微生物因素、免疫因素和遗传因素。目前,通过外源化学物刺激诱导肠黏膜产生免疫反应来建立IBD模型是较常用的方法。有研究报道利用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)诱导的IBD模型与人类的CD相似。本研究利用TNBS诱导建立了炎性肠病大鼠模型并对该模型进行了初步评价。实验大鼠的造模和病理切片的制备1.材料:实验动物为SPF级雄性Wistar大白鼠,体重160±20g,购自军事医学科学院动物中心。TNBS为Sigma公司产品,浓度5%(即50g/L),使用前配制成2.0%TNBS(5%TNBS10ml+无水乙醇10ml+生理盐水5ml)。2.方法:将50只雄性Wistar大鼠随机分为3组,TNBS造模组20只,对照组18只,正常组12只。实验动物禁食24h后,用30g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,大鼠用特殊的硅胶导管导入距肛门约8cm的结肠内,TNBS造模组缓慢注入2.0%TNBS,剂量为100mg/kg体重;乙醇对照组灌注等量50%乙醇,正常对照组仅灌注等量生理盐水。在导入药液的时候采取头低尾高的体位,防止灌注液体外溢,并倒提大鼠30s。造模后大鼠平躺,自然清醒,常规饲养。每天观察大鼠的粪便性状、进食情况和精神状态,并记录体重和食重。各组大鼠分别于造模后第3、6、14天用戊巴比妥钠麻醉后处死4只,取病变明显部位结肠组织,进行病理切片制作,HE染色后显微镜下观察。3.数据处理:数据分析结果以x¯±sx¯±s表示,所测数据用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析的LSD检验,以P≤0.05为有统计学意义。结果1.皮肤正常并无异常率TNBS造模组大鼠造模后第1天即出现稀便、少动、畏寒等症状,且大部分稀便带血,精神状态不佳,皮毛也变得粗糙、不光滑,稀便和血便状况持续大约8天。造模对照组中部分大鼠在造模后第1天出现稀便,但第2天即恢复正常,精神和活动状况正常,皮毛光滑。正常对照组大鼠未见异常。在整个实验过程中,TNBS造模组大鼠造模后共死亡3只,占造模组的15%,其他组均无死亡发生。2.大鼠体重至造模前的合成如图1和图2所示,TNBS造模组大鼠造模后进食量明显减少,并且体重也持续下降。造模后第5天食量开始有所增加,至第8天达到造模前食量;体重于造模后第7天开始增加,至第10天才恢复至造模前的水平。造模对照组大鼠于50%乙醇灌肠后第1天进食量有所减少,体重也稍有下降,但第2天即开始回复,第3天即达到并超过造模前水平。正常对照组大鼠体重和进食量在生理盐水灌肠后没有发生明显下降,并于灌肠后第2天超过造模前水平。3.肠黏膜组织修复TNBS造模组大鼠造模后第3天结肠黏膜充血,黏膜上皮中度受损,黏膜下层见大量中性炎性细胞浸润,肠壁发生水肿,可见出血病灶,隐窝结构中度受损(封三彩图7A);第6天可见黏膜糜烂,肠壁坏死并深达肌层,炎细性胞浸润肠壁全层,黏膜及腺体脱落形成大面积溃疡灶,肠壁水肿明显(封三彩图7B);第14天肠黏膜结构基本恢复完整,坏死腺体得以修复,腺体数量较少,腺体间有纤维组织修复瘢痕,许多腺体内可见黏液潴留(封三彩图7C)。造模对照组大鼠除仅在第3天镜下观察可见黏膜轻度损伤,肠壁轻度水肿,并伴有少量炎性细胞浸润,腺体结构未见明显异常,无出血病灶形成(封三彩图7D)外,其余时间观察结果与正常组观察结果基本一致(封三彩图7E、7F)。tnbs造模的生物学特性炎性肠病在西方国家相当常见,尽管在亚洲国家的发病率低于西方,但近10年亦呈上升趋势。国内由于过去一直认为本病少见而重视不够,但近年据报道也已经超过2万人,并且新病例还在不断发现。IBD病因和确切的发病机制至今尚不清楚,治疗亦颇为棘手。理想的动物模型是进行病理、病因及相关治疗药物研究不可缺少的工具。目前,TNBS诱导的大鼠肠损伤模型已广泛用于人类各种肠道病变发病机制的研究。TNBS是一种弱有机酸,属于半抗原,单独在体内不能诱导免疫应答,只有在与组织蛋白等高分子物质结合后才能诱发免疫反应,因此造模时需用乙醇作为肠黏膜屏障的破坏剂,使得TNBS与肠黏膜角蛋白结合成全抗原,从而激发局部免疫反应。TNBS造成的肠损伤与人类的CD在发病机制、病理特点及临床表现等方面相似,其典型特征是结肠发生透壁性坏死和广泛的炎性细胞浸润,并且伴随着体重的持续下降。以往有文献报道采用较大剂量的TNBS诱导的炎性肠病模型,虽然模型制备成功但病死率较高,约为40%。本研究采用较文献报道剂量稍有降低的2%TNBS按100mg/kg体重对大鼠进行灌肠,从实验结果中可以看到TNBS造模组在造模后体重持续下降,直至第10天才恢复至造模前水平,病理切片观察在造模后第6天也发现肠壁坏死并深达肌层,炎性细胞浸润肠壁全层,这些都是典型的炎性肠病特征,表明该方法制备炎性肠病模型是成功的,并且采用上述方法造模使模型动物的病死率得到显著控制,为15%。从本实验造模大鼠结肠组织的病理变化观察中我们发现,TNBS造模后第