基于caco-2细胞模型的小柴胡汤的吸收和转运机制研究

基于caco-2细胞模型的小柴胡汤的吸收和转运机制研究

小柴胡汤是汉代张仲景《伤寒论》中关于少阳病的主要方剂。它也是八个法律中“和”法的代表方。由柴胡、黄芩、党参、半夏、甘草、生姜、大枣7味药组成。以寒热往来、口苦咽干、胸胁苦满、舌苔薄白、弦脉为辨证要点,为和解少阳之代表方剂。近年来,对小柴胡汤的应用进行了大量临床及实验研究,其适应范围已扩大到临床各科,尤其对发热、病毒感染、肝脏疾病等有较好的疗效。目前,对小柴胡汤药代动力学研究,大多数都集中在动物和人体体内过程的研究,且大多集中在对复方中黄芩苷或者甘草酸的研究,利用体外模型对小柴胡汤的吸收进行研究还未见报道。Caco-2细胞系(humancoloncarcinomacellline)来源于人结肠腺癌细胞,在体外培养条件下即可在有孔的聚碳酸酯膜或聚酯膜上分化为肠上皮细胞单层,具有细胞极性及微绒毛等结构,可表达各种蛋白载体和酶,被认为是目前较理想的体外吸收模型。利用该模型,可在体外对药物的摄取、代谢、排放、转运等进行研究。本研究利用Caco-2细胞模型研究小柴胡汤的吸收特性和转运机制,为揭示小柴胡汤药效物质基础和毒性提供理论依据。1材料表面1.1药品和化学品Caco-2细胞株购自美国ATCC(AmericanTypeCultureCollection)。小柴胡汤提取物由四川省中医药科学院中药化学研究所提供,批号20071220。DMEM培养基和胰蛋白酶购自美国Gibco公司;荧光素钠、Hank′s缓冲溶液(HBSS)、I型鼠尾胶原、乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和非必需氨基酸(NEAA)购自美国Sigma公司;胎牛血清(FBS)购自澳大利亚PAA公司;青霉素和链霉素购自华北制药有限公司;汉黄芩苷(wogonoside,WGS)、汉黄芩素(wogonin,WGN)、黄芩苷(baicalin,BCN)、黄芩素(baicalein,BCE)和甘草酸单铵盐(ammoniumglycyrrhizinate,AG)对照品均购自中国药品生物制品检定所;乙腈为色谱纯(美国Fisher);甲醇为色谱纯(德国Merck公司);其余试剂均为分析纯。1.2细胞显微观察Millicell悬挂式培养皿(聚酯膜,孔径1.0μm,膜面积4.52cm2)、90mm平板式除菌过滤器、超纯水系统和Millicell-ERS跨膜电阻仪(Millipore,美国);3111水套式CO2培养箱(Forma,美国);DMLL倒置相差显微镜(Leica,德国);XSZ-H7双目生物显微镜(重庆光电仪器公司);Cytorecon全自动细胞分析仪(GE,美国);SW-CJ-2F双人双面超净工作台(苏州净化设备有限公司);ALLEGRAX-15R台式冷冻离心机(Beckman,美国);日立H-600IV型透射电镜;MULTISKANMS酶标仪(英国);MLS-3070高压灭菌锅(日本三洋公司);YDS-50B-80液氮容器(乐山市东亚机电工贸有限公司);Waters高效液相色谱仪(2695-2996),EmpowerPro色谱数据工作站;CP-225D型精密电子天平和PB-10酸度计(Sartorius)。2方法2.1小柴胡汤颗粒制备工艺处方:柴胡360g,黄芩135g,半夏(姜制)135g,党参135g,生姜135g,甘草135g,大枣135g。参考《中国药典》2005年版小柴胡汤颗粒的制备工艺,以上7味,以水煎煮3次,第1次加10倍量水,煎煮2h,第2,3次各加8倍量水,煎煮1h,合并煎液,滤过,滤液过大孔吸附树脂柱,先用70%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收乙醇,浓缩干燥,即得,收率约为4%。称取小柴胡汤提取物100mg,加入100μLDMSO溶解,再用DMEM培养基定容至10mL,即质量浓度为10g·L-1,0.22μm滤膜过滤,实验时用DMEM培养基稀释成不同浓度。2.2细胞培养milicarloCaco-2细胞在DMEM培养基(含10%FBS,1%NEAA,100U·mL-1青霉素-链霉素,10mmol·L-1HEPES),37℃,5%CO2恒温培养箱中培养。每3d按1∶3传代1次。取对数生长期的细胞按1.5×105个/mL接种在Millicell培养皿中。接种后隔天换液1次,7d后每天换顶侧(apicalside,AP)液体,隔天换底侧(basolateralside,BL)液体。培养21d后,对细胞模型进行验证,选取细胞跨膜电阻大于600Ω·cm2及荧光素钠透过率低于0.6%·h-1·cm-2的细胞进行药物转运实验。2.3细胞活力检测取对数生长期Caco-2细胞,制成细胞悬液,调节细胞密度为2×104个/mL,接种于96孔板,每孔加入200μL细胞悬液,培养18h后吸去培养液,换成含不同浓度小柴胡汤(0.1,0.3,0.5,0.7,0.9,1,2,3g·L-1)的培养液,空白对照组用DMEM培养液,溶剂对照组为含0.1%二甲基亚砜的DMEM培养液。继续培养24h后,加入5g·L-1MTT20μL,培养4h,吸尽上清液,加入200μL二甲基亚砜,震荡10min,用酶标仪在492nm处测定吸光度A。取8孔A的均数,按公式求细胞存活率(IC)。IC=[(A实验孔-A调零孔)/(A对照孔-A调零孔)]×100%求出98%的细胞存活所对应的药物浓度(IC98),作为小柴胡汤的最大无毒浓度。转运实验选择低于此剂量的浓度。2.4小柴胡汤转运液的制备细胞用HBSS液小心清洗3次,最后一次在培养箱中孵育30min,吸干HBSS液。空白对照组在AP和BL两侧均加HBSS液,给药组在给药侧加入含600mg·L-1小柴胡汤的HBSS液(AP侧2mL,BL侧4mL),接收侧加入空白的HBSS液。然后把培养板放入培养箱中孵育,分别收集BL侧和AP侧在0,30,60,90,120min的溶液300μL,取样后加入空白HBSS液300μL,样品置于-20℃冰箱冻存。用HPLC定量分析转运液中的化学成分。转运实验结束后,将Caco-2细胞单层用HBSS洗涤3次,然后加入2mL甲醇,提取蓄积在Caco-2细胞中的小柴胡汤各成分,用HPLC定量测定蓄积在Caco-2细胞中的化学成分。2.5小柴胡汤样品2%磷酸检测HPLC色谱条件:SymmetryShieldTMRP18色谱柱(4.6mm×250mm,5.0μm);流动相乙腈-0.01%磷酸溶液梯度洗脱;流速0.45mL·min-1;检测波长251nm;柱温30℃。样品处理:冷冻干燥小柴胡汤转运样品和空白HBSS转运液,加入等量甲醇,超声30min,15000r·min-1离心10min,取上清液30μL进样测定;细胞内甲醇提取液除菌过滤后,取30μL进样测定。选择小柴胡汤中黄芩黄酮类成分(汉黄芩苷、汉黄芩素、黄芩苷、黄芩素)和甘草酸做为指标性成分。3结果3.1生物样品的分离和代谢在本试验条件下,BCN,WGS,BCE,WGN和AG的分离度良好,R>1.5,生物样品中内源性物质,代谢产物及小柴胡汤中其他化学成分未见干扰。3.2g标准曲线及线性范围BCN,WGS,BCE,WGN和AG标准曲线回归方程见表1,各成分的相关系数均大于0.999,表明各成分在各自的浓度范围内线性关系良好。3.3加回收率的rsd小柴胡汤中各成分低、中、高3个浓度的日内精密度、日间精密度和相对回收率的RSD均小于6%,相对回收率BCN为94.2%~105.92%,WGS为98.86%~102.38%,BCE为99.04%~105.92%,WGN为99.67%~102.88%,AG为94.22%~101.29%。3.4稳定性小柴胡汤中各成分在HBSS中、-20℃冰箱保存14d,含量没有明显变化,各浓度样品测定值的RSD均小于7.5%。3.5小柴胡汤对小鼠细胞存活率的影响小柴胡汤的质量浓度≤0.7g·L-1时细胞存活率均大于98%,当小柴胡汤的质量浓度高于0.7g·L-1时,随小柴胡汤浓度的增加,细胞存活率降低。3.6双向转运caco-2细胞的表达小柴胡汤在Caco-2细胞模型的双向累积转运情况见表2,双向转运的表观渗透系数见表3,小柴胡汤中WGS,WGN能透过Caco-2细胞单层,BCN,BCE和GA不能透过Caco-2细胞单层。3.7蓄积量的情况小柴胡汤中5个化学成分在Caco-2细胞中的积蓄情况见表4。BCN和WGSAP侧给药的摄取量小于BL侧(P<0.05),BCL,WGN和GA的双向摄取量相当。4小柴胡汤中微量元素的含量药物在Caco-2细胞上的被动转运程度与口服体内吸收情况的相关比较说明Caco-2细胞模型在预测药物吸收方面具有重要作用。吸收完全的药物具有较高的表观渗透系数(Papp>1×10-6cm·s-1),而吸收不完全的药物的渗透系数则较低(Papp<1×10-7cm·s-1)。更多研究显示,在复杂的吸收模型中(如在体灌注模型),药物吸收程度的试验结果与Caco-2细胞单层研究结果相一致,表明Caco-2细胞单层可用于研究药物的吸收性质。小柴胡汤转运试验结果显示,WGS和WGNAP侧到BL侧转运的表观渗透系数分别为(1.23±0.09)×10-6,(1.07±0.89)×10-5cm·s-1,都大于1×10-6cm·s-1,说明小柴胡汤中这2个成分较易吸收。WGS和WGN的转运率随着时间的增加而增加,WGS和WGN的PappAP→BL/PappBL→AP分别为0.58,1.49,提示这2个成分在Caco-2细胞单层模型中的转运途径可能为被动转运,WGS的PappAP→BL/PappBL→AP较小,从BL侧到AP侧的外流转运较占优势,其转运过程中可能存在的外排机制,还需进一步的实验验证。在跨膜转运液中,检测不到BCN,BCL和GA。研究资料显示,BCN口服首先在肠腔内受肠道菌丛的作用转化成苷元,然后吸收,在小肠黏膜中受葡醛酸转移酶催化,重新代谢为BCN;GA在肠内细菌转化产生18β-甘草次酸,转化产物吸收入血进入肝脏,Takeda等采用肠道无菌大鼠作模型,发现无论静脉注射或口服给予GA,血中均未能测到GA和甘草次酸。说明这2种成分需要经过肠内细菌转化才能被小肠吸收,而Caco-2细胞上没有肠内细菌,所以BCN和GA均不能透过Caco-2细胞单层,这与体内研究报道一致。小柴胡汤中BCL不能透过Caco-2细胞单层膜,推测可能与小柴胡汤中各成分相互作用有关。对小柴胡汤中5个成分双向摄取情况研究发现,BCN和WGSAP侧给药的摄取量小于BL侧的摄取量(P<0.05),这2个成分可能为P-gp的底物,药物进入细胞,P-gp就会将其排到肠腔侧。BCL,WGN和GA的双向摄取量相当,提示小柴胡汤中这3个成分的摄取可能未受到主动转运载体的介导,而是以被动扩散为主要方式被细胞摄取。ADME/Tox是近年发展起来的、在细胞层次水平上早期进行活性与吸收、分布、代谢、清除和毒性实验的新型并行研究模式,C