氯羟吡啶衍生物的合成及抗血清的免疫研究

氯羟吡啶衍生物的合成及抗血清的免疫研究

氯羟吡啶也被称为克球酚，它被称为3、5-二氯二氯二和6-4-硝基吡啶。这是一种由磺酰胺类、5-羟色胺和6-硝基二氯二氯-4引起的预防家禽株昆虫疾病的药物添加剂。研究结果表明,氯羟吡啶对大鼠有一定致畸和胚胎毒性作用(姜中其等,1999),对小鼠有弱致突变作用(包鸿俊等,1992)。沈建忠等(1997)所做鸡代谢试验也表明,该药物主要残留于肝脏和肌肉,停药7d后仍能在试验动物组织内测定到较高含量药物。正是由于长期使用或不按规定用药造成氯羟吡啶在动物体内和组织中残留以及由此对人体造成的潜在威胁,目前欧盟、美国、加拿大、日本以及中国等都规定了各种动物组织中氯羟吡啶残留最高限量标准(李俊玲,2005)。氯羟吡啶的常规检测方法主要有气相色谱法(Ekström等,1984)、高效液相色谱法(农牧发38号,2001)、气相色谱质谱法(He等,2005)和液相色谱质谱法(Pang等,2000)。这些仪器方法主要依赖于大型进口设备,是目前国家级检测单位和各级政府、出入境等检测单位的常用方法,众多相关国家、地方和行业检测标准均是以这些方法为基础(GB/T20362,2006)。其检测结果准确,但操作复杂,尤其是仪器设备采购成本高,维护成本更高,一般企业和基层检测单位难以承受。由于中国养殖模式复杂,散养模式依然占据主流地位,因此要控制相关药物残留,确保上市产品达标,推广快速方便,适合于基层检测单位使用的方法和手段势在必行。目前报道的快速检测方法有电化学法(柴春彦等,2006)和酶联免疫吸附测定法等(谢忠良,2009)。其中ELISA法是目前在食品安全检测领域中应用最为广泛和成熟的技术之一(张也等,2003),其检测方便、操作简单、成本低、耗时短、无须昂贵仪器等,已经被广泛接受而作为快速筛选方法而列入国标中(农业部1025号公告,2008)。本研究旨在合成氯羟吡啶抗原和制备相应抗血清,为ELISA检测方法建立奠定基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1其他抗基因药物氯羟吡啶标准品、尼卡巴嗪、氯苯胍、地克珠利和磺胺喹恶啉等标准品采购自Sigma公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三正丁胺等购自某化学有限公司;血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)购自上海某生物科技有限公司;羊抗鼠酶标记和羊抗兔酶标记二抗购自北京某公司;单组份TMB底物购自北京某公司;其余试剂购自北京化学试剂公司。除特殊说明外,试验所用水为三蒸水,化学试剂为分析纯。1.1.2水质、酶标板和动物紫外分光光度计为日本某公司产品,MK3酶标仪购自热电公司,XevoTQ-S质谱购自美国Waters公司,酶标板为热电公司产品,BALB/c小鼠由北京某生物技术有限公司友情提供。1.2方法1.2.1氯乙酸钠溶液配制氯羟吡啶分子结构简单,没有羧基或氨基等活性基团,无法直接与蛋白偶联。本研究在其羟基上延伸,构造出含有羧基的氯羟吡啶衍生物(图1),具体操作为:取4.8g(25mmol)氯羟吡啶原料,加入到氢氧化钾2.8g(50mmol)用15mL水溶解,使之溶解,用20mLDMF充分搅拌稀释,加入无水碘化钠0.11g(0.73mmol)搅拌,取3.48g(30mmol)氯乙酸钠溶于5mL去离子水,缓慢加入到氯羟吡啶溶液中,用油浴升温,60℃搅拌充分搅拌过夜12h。反应结束后,旋蒸干燥除去溶剂与水,得到浅黄色固体,加适量约30mL水溶解,调节pH到5左右,有大量白色固体析出,过滤除去水溶液,反复用20%乙醇溶液冲洗3次,再用去离子水20mL冲洗抽滤去清液,除去无机盐,过量氯乙酸钠等杂质,得白色固体粉末,烘干即为氯羟吡啶半抗原粗品。将所得半抗原用质谱进行扫描分析,确定合成结果。1.2.2偶联产物clop-bsa的合成采用活性酯法合成氯羟吡啶人工免疫原,操作如下:准确称取75mg氯羟吡啶半抗原溶解于5mLDMF中,加入62.5mg二环已基碳化二亚胺(DCC)和34.5mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS),在室温下磁力搅拌下反应过夜12h,此液称为A。另称取150mgKLH溶于5mL碳酸钠缓冲液(0.05mol/L,pH9.6),此液为B。将反应液B放置于磁力搅拌器上4℃平衡1h后,将反应液A缓慢滴加到反应液B中,搅拌反应过夜。再将反应液置于经预处理过的透析袋内用磷酸盐缓冲液(0.02mol/LpH7.4)4℃透析5d,得到偶联产物CLOP-KLH,分装后冻存于-20℃备用。采用氯甲酸异丁酯法合成氯羟吡啶人工包被原,操作如下:准确称取75mg氯羟吡啶半抗原溶解于5mLDMF中,4℃下磁力搅拌,先滴加入150μL三正丁胺,反应30min,再加入100μL氯甲异丁酯,搅拌反应1h,此为反应液A。另称取200mgBSA溶于10mL碳酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH9.6)中,放入冰箱中预冷1h,此为反应液B。在4℃冰箱中磁力搅拌下,将反应液A缓慢滴加到反应液B中,继续4℃搅拌反应过夜。再将反应液置于经预处理过的透析袋内用磷酸盐缓冲液(0.02mol/LpH7.4)4℃透析5d,得到偶联抗原CLOP-BSA。分装后冻存于-20℃备用。1.2.3蛋白浓度的计算将抗原稀释一定的倍数,然后采用紫外分光光度法分别测定D280nm和D260nm,利用经验公式计算蛋白浓度(杨利国,1998)。根据测定结果将氯羟吡啶半抗原、BSA及偶联物配制成固定浓度,然后扫描出半抗原及BSA的最大吸收波长,分别测定氯羟吡啶半抗原、BSA及偶联物在两最大吸收波长处的吸收值,根据杨利国等(1998)提供的方法计算偶联比例。1.2.4小鼠分组及免疫将制备好的抗原用PBS稀释至1mg/mL作为储备液。分别以100μL和500μL的剂量皮下多点免疫BALB/c小鼠,免疫间隔为2周。3次免疫的第10天眼眶采血,间接法测定血清效价,同时测定抗血清对尼卡巴嗪、氯苯胍、地克珠利和磺胺喹恶啉等药物的交叉反应。2结果2.1出现理论分子质量相同的代物抗原用质谱扫描鉴定,结果见图2。所合成的半抗原为氯羟吡啶的羟基取代物,其理论分子质量为254,与图中标注峰值分子质量相同,表明抗原合成成功。免疫抗原和包被原浓度经紫外法测定分别为8.02mg/mL和5.23mg/mL,偶联比率分别接近于15∶1和10∶1。2.2价值对d值的影响分别于第3次免疫、第4次免疫后测定效价,结果见表1。由表1可知,第3次免疫后血清效价为1∶1000时,D值较低(<0.6),但对20ng/mL的氯羟吡啶标准品抑制较好。第4次免疫后,血清效价普遍提高,5号血清效价最高,10ng/mL标准品抑制达到47.2%。5号血清经调试,测定交叉反应和灵敏度(标准曲线),结果见表2和图3。3讨论3.1elisa法在食品筛选中的应用中国畜禽业目前还以散养模式为主,多数养殖者技术水平有限,虽有食品安全意识但无科技知识,因此如何从基层和源头控制食品安全才是实现安全食品的基础。ELISA方法作为快速筛选方法尤其适合于基层应用,作为一种快速筛选的检测手段,可以有效地保障食品安全。氯羟吡啶残留检测目前还无市售试剂盒检测产品,因此很有必要开发此类检测产品,填补市场空缺,满足基层食品安全检测的需求。3.2氯羟吡啶半抗原的制备氯羟吡啶抗原合成的关键点有两方面:(1)在于半抗原的制备,氯羟吡啶化学稳定性较好,在常规有机溶剂中也很难溶解,只有在碱性条件下才有良好的溶解性。此外,该药物分子结构的活性基团不多,酚羟基的活性较弱,采用酸酐酰化的方法制备半抗原比较困难,因此采用含有卤代烃的醋酸钠在碱性条件下取代反应得到氯羟吡啶半抗原后,用含乙醇的溶液清洗出去其它的溶剂和大部分杂质,无需过硅胶柱层析纯化就可以得到氯羟吡啶半抗原。(2)人工抗原制备免疫原,采用血蓝蛋白KLH作为载体蛋白具有良好的免疫原性,但KLH在纯水中不好溶解,需要预先用缓冲液充分溶解,用经典的DCC活性酯法偶联全抗原可以得到较好的氯羟吡啶人工抗原,而包被抗原采用牛血清白蛋白BSA作为载体蛋白,和经典的氯甲酸异丁酯法偶联全抗原偶联率也比较好。3.3单克隆抗体的制备本研究制备多克隆抗体前期选择了新西兰大白兔和BALB/c小鼠,都得到了较好的测定结果。但由于单克隆抗体来源稳定,在拥有杂交瘤细胞株的情况下可源源不断地获取抗体,所以试验最终报告的是鼠血清结果。从该结果可以看出,鼠血清效价较高,同时氯羟吡啶标准品抑制明显,在10ng/mL抑制了47.2%,非常适合于单抗制备。抗原合成后制备血清的测定结果也