高效液相色谱-串联质谱法同时测定虾中9种磺胺类抗生素残留

高效液相色谱-串联质谱法同时测定虾中9种磺胺类抗生素残留

磺胺类药物（sas）是一种含有氨基丙烯酸的药物的总称，也是一种常见的光谱抗生素。因其具有抗菌谱广、高效、低毒和价格低廉等特点,在水产养殖中被广泛使用。人类经常食用有磺胺类药物残留的动物源性食品,就可能引起磺胺类药物在体内的逐渐累积,其危害性主要表现为细菌耐药性、过敏、造血紊乱、致癌作用以及激素样作用等。目前中国、欧盟、美国、日本等均将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物,其最大残余限量一般为50~100μg/kg。目前,用于抗生素的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫分析法(ELISA)、气相色谱法(GC)、高效毛细管电泳法(HPCE)、液相色谱-质谱法(HPLC-MS/MS)等方法。本文采用高效液相色谱-质谱法,建立检测虾中9种磺胺类药物残留的方法。1材料和方法1.1标准储备液的配制液相色谱仪(配有四元泵,Agilent公司),质谱检测器(API3000,AB公司),液相色谱柱(菲罗门GeminiC18,5μm,4.6×150mm),组织捣碎机,电子分析天平(感量为0.01g,上海梅特勒公司),涡旋混合器(德国IKA公司),超声波清洗机,冷冻离心机(SIGMA公司),0.45m有机微孔滤膜。乙腈、甲醇、异丙醇、正己烷和醋酸铵为色谱纯(美国TEDIA公司);无水硫酸钠(经650℃灼烧4h,置于干燥器皿内备用)为分析纯;水为去离子水。磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉和磺胺甲恶唑均来自于德国Dr.公司。标准储备液的配制(400μg/ml):分别准确称取磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉和磺胺甲恶唑10.0mg(准确至0.1mg),置于25ml容量瓶,用少量甲醇溶解,并用甲醇定容至刻度,混匀,浓度为400μg/ml浓度,置于4℃冷藏避光保存。混合标准储备液:分别准确量取1.000ml9种磺胺类药物标准储备液,用甲醇定容至100ml,浓度为40μg/ml的标准中间液,置于4℃冷藏避光保存。1.2样品前处理1.2.1样品的制备1.2.2操作工艺准确称取样品5.00g于50ml离心管中,加入约10g无水硫酸钠,涡旋混匀;加入20ml乙腈提取液,涡旋混匀2min;4000rpm离心5min,取上层清液,再次加入10ml乙腈提取液,涡旋混匀2min;4000rpm离心5min,合并上层清液,加入2ml异丙醇,于40℃水浴下旋转蒸发至干。准确加入1.00ml乙腈+水(10∶90),涡旋后再加入0.5ml正己烷涡旋,转移入1.5ml离心管,15000rmp离心5min,取下层溶液过0.45μm有机滤膜到进样瓶中,供液相色谱-质谱仪测定。1.3分析条件1.3.1醋酸铵溶液样品2色谱柱:菲罗门GeminiC18,5μm,4.6×150mm或相当者;进样量:50μl;柱温:30℃;流动相:A相为乙腈、B相0.50mmol/L醋酸铵溶液;流速:0.80ml/min;梯度洗脱条件见表1。1.3.2氮气在器、困境b大气电喷雾离子源ESI,正离子模式;多反应监测(MRM);离子源喷雾器电压(IS):5500V;离子源温度:450℃;帘气0.4MPa、雾化气0.6MPa、辅助加热气0.7MPa、碰撞气0.4MPa均为高纯氮气;使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。2结果与讨论2.1结果2.1.1标准工作曲线的绘制配制浓度为0.0、5.0、12.5、25.0、50.0、100.0ng/m的标准溶液,按设定色谱条件进行线性分析,以溶液浓度(ng/ml)为X,对峰面积为Y绘制标准工作曲线。结果表明,各种化合物的质量浓度在0~100ng/ml范围内线性良好,相关系数均大于0.9990。2.1.2检出限的测定在5μg/kg添加水平时,各药物峰的信噪比均大于3,故将其定为检出限。在10μg/kg添加水平时,各药物峰的信噪比均大于10,且回收率、相对标准偏差(RSD)满足条件,故将其定为定量限。2.1.3标准溶液的提取、净化及色谱分析以阴性虾为基质,分别向其中加入5μg/kg和10μg/kg浓度的磺胺类药物混合标准溶液,进行提取、净化及色谱分析。每个添加水平作6份平行测定,结果表明:平均回收率为75.3%~95.6%;相对标准偏差为4.5%~13.5%;结果见表2。2.2讨论2.2.1氯甲烷提取以乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷作为提取剂,在同一添加水平和相同试验条件下:经乙酸乙酯提取检测时发现磺胺嘧啶、磺胺喹恶唑等回收率低,且提取液也将样品中大量脂肪带入,使净化难。二氯甲烷提取液浑浊,净化难度大。乙腈提取效率最高,脂肪带入少,易净化,但是由于样品组织中水较多,导致浓缩效率低,因此在加入乙腈前,先加入无水硫酸钠除水。为使其蒸发效率加快,加入异丙醇可使乙腈旋转蒸发时避免爆沸,在定容后再加少量正己烷除去剩余脂肪。2.2.2色谱条件优化,实现了sas的分离流动相的pH值对SAs的分离和保留具有显著的影响。实验比较了不同浓度的甲醇乙酸、甲酸与乙腈配比梯度洗脱,比较发现乙腈、0.50mmol/L醋酸铵溶液为流动相,可以保证理想的分离度,同时配上合适的梯度淋洗条件,较好地实现了SAs的分离,9种磺胺类药物均能达到基线分离,峰形尖锐,峰对称性好。2.2.3[m+h]+离子谱图根据磺胺药物的分子结构,实验表明:磺胺在离子源ESI+电离方式下,通过全扫描确定[M+H]+离子峰,分别以此为母离子进行二级质谱分析,找出二级质谱中两个信号最强的碎片离子,以母离子和子离子组成监测离子对,见表2。以MRM的方式对样品进行定性和定量分析,如图1所示。3高效液相色谱法检测本方法以乙腈-0.50mmol/L醋酸铵溶液为流动相,采用离子源ESI+;多反应监测(MRM)检测