第九章基因诊断

第九章基因诊断第1页，课件共69页，创作于2023年2月第一节 基因诊断的概念 及常用技术第2页，课件共69页，创作于2023年2月基因诊断—利用分子生物学技术，从 DNA/RNA水平检测基因的存在,分析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。一、基本概念第3页，课件共69页，创作于2023年2月二、基因诊断常用方法㈠ 核酸分子杂交㈡ PCR㈢ DNA序列测定㈣ DNA芯片技术第4页，课件共69页，创作于2023年2月(一) 核酸杂交基本原理-------核酸变性和复性理论

即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在与其互补的同源核苷酸序列。第5页，课件共69页，创作于2023年2月probeprobe第6页，课件共69页，创作于2023年2月核酸杂交的关键要素probeDNAtargetDNAsignaldetection第7页，课件共69页，创作于2023年2月核酸杂交方法分类按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。第8页，课件共69页，创作于2023年2月固相杂交分类Southern印记杂交Northern印记杂交斑点杂交原位杂交第9页，课件共69页，创作于2023年2月Southernblot是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定量和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。第10页，课件共69页，创作于2023年2月Northern杂交用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析。第11页，课件共69页，创作于2023年2月斑点杂交（Dotblot）可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。第12页，课件共69页，创作于2023年2月原位杂交

（Colonyinsituhybridization）可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。第13页，课件共69页，创作于2023年2月（二）利用PCR及结合其他技术进行基因诊断直接采用PCR进行基因诊断采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLPs）进行基因诊断采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）斑点杂交进行基因诊断*通过PCR产物的反相点杂交(RBD)进行基因诊断采用PCR产物的单链构象多态性(SSCP)分析进行基因诊断采用PCR技术对靶核酸进行定量分析第14页，课件共69页，创作于2023年2月寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特异寡核苷酸杂交（ASO）#第15页，课件共69页，创作于2023年2月（三）DNA序列测定

DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位，突变的性质。第16页，课件共69页，创作于2023年2月（四）DNA芯片技术

应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。第17页，课件共69页，创作于2023年2月二基因诊断的特点高特异性高灵敏度获得稳定的结果早期快速适用性强，应用范围广第18页，课件共69页，创作于2023年2月第二节遗传病的基因诊断第19页，课件共69页，创作于2023年2月一、概述人类的遗传病达数千种地中海贫血在意大利等国家发病率达10％镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14％我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异常血红蛋白病和血友病。有效治疗难；通过基因诊断进行携带者筛查，产前早期诊断，降低发病率。第20页，课件共69页，创作于2023年2月二、镰状细胞贫血血红蛋白病（异常血红蛋白病）红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。患者多在成年以前死亡第21页，课件共69页，创作于2023年2月×MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb（一）镰状红细胞贫血分子机制5 6 7--Pro Glu Glu—--CCT

GAG

GAG--5 6 7--Pro Ala Glu—--CCT

GTG

GAG--第22页，课件共69页，创作于2023年2月（二）镰状细胞贫血的基因诊断方法限制性内切酶/Southernblot 采集制备血液DNA→内切酶MstⅡ消化→电泳→转膜→32P标记的β珠蛋白cDNA杂交→放射自显影第23页，课件共69页，创作于2023年2月+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析第24页，课件共69页，创作于2023年2月PCR/限制性内切酶设计引物→PCR扩增→产物进行限制性内切酶酶切→电泳→EB染色→直接观察例：引物1：5’-GGGCTGGGCATAAAAGTCA-3’引物2：5’-AATAGACCAATAGGCAGAG-3’ 扩增产物294bp镰状细胞贫血的基因诊断方法第25页，课件共69页，创作于2023年2月引物1CCT

GAG

GAGCCT

GTG

GAG引物1引物2引物2294bp103bp191bpMstⅡ酶切位点(CCTNAGG)第26页，课件共69页，创作于2023年2月+﹣103bp191bp294bp正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析第27页，课件共69页，创作于2023年2月RT-PCR/序列分析

采集制备血液RNA→RT-PCR→产物测序→推测氨基酸序列→进行诊断镰状细胞贫血的基因诊断方法第28页，课件共69页，创作于2023年2月二、β－地中海贫血

(β－Thalassaemia,简写βthal或βT)β珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少（β＋）或完全缺失（β0）β珠蛋白合成速率降低，导致β链和α链合成的不平衡→多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上→改变了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。缺乏有效治疗措施。第29页，课件共69页，创作于2023年2月（一）β地贫病的分子基础β珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子（IVS－I和IVS-II），3个外显子。目前发现突变有百余种，中国人群发现约20种；一般对特定种族来说，90%的β地贫基因仅由4～6种突变组成。第30页，课件共69页，创作于2023年2月（二）β地中海贫血的基因诊断PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和580bp，分别包含14种和1种可能突变）→合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（4～6对，分别标记） →制备DNA样品 →PCR扩增 →斑点印迹杂交RFLP分析法第31页，课件共69页，创作于2023年2月三α地中海贫血的基因诊断ac左侧缺失4.2kb右侧缺失3.7kbbbbaα2α1α1α2N端α1C端正常基因序列PCR扩增法——定性分析左侧缺失型基因序列右侧缺失型基因序列ac扩增0.4kbab无扩增片段ab扩增1.2kb第32页，课件共69页，创作于2023年2月+﹣0.4kb1.2kb正常人右侧缺失患者地中海贫血患者基因组的PCR分析左侧缺失患者第33页，课件共69页，创作于2023年2月四、杜氏肌营养不良症（DMD）

1.DMD是常见的性连锁隐性遗传病，2.主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，XP21.21—21.3区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同。DMD多在5岁发病，10岁左右瘫痪，在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其发病率为活产男婴的1/3500。

第34页，课件共69页，创作于2023年2月（一）DMD分子基础：抗肌萎缩蛋白基因长约2900kb，含79个外显子。抗肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非基因缺失型。（1）DNA片段缺失（60%的病例→导致阅读框移码→移码实变→致DMD，整码缺失→BMD）。缺失的2个热点区①该基因5’端处②45~55外显子范围内。（2）非基因缺失型部分重复（病例的5%）第35页，课件共69页，创作于2023年2月（1）基因组探针法 用XP21区分离得到的不同探针如（P20）来进行相应内切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。（2）cDNA探针法 抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失、外显子拼接改变和基因内部分重复。（3）多重PCR法 如有人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因的9个易发缺失“热点区”DNA片段，可检出80%有基因缺失的DMD患者。（4）多态性分析法 基因内及其旁侧探针进行RFLP连锁分析。（5）RT—PCR扩增该基因外显子（全长2.4MB、外显子起来全长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。联用测序：可定位基因缺失的起始和终止。第36页，课件共69页，创作于2023年2月1、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。2、主要特征：（1）苯丙氨酸酪氨酸→多巴→儿茶酚胺苯丙酮酸酪胺黑色素

（2）患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗，否则发生不可逆大脑损害和严重智力发育障碍。

苯丙氨酸羟化酶↓（肝）五、苯丙酮尿症（PKU）第37页，课件共69页，创作于2023年2月（一）PKU分子基础（1）迄今约3/4的导致中国人PKU的突变基因已被查清，它们分属11种PAH基因点突变。体外研究表明，这些突变导致PAH活力↓或丧失。（2）PAH第11外显子的第399密码GTA（val）→GTT（val）中性突变：①不改变任何限制酶识别位点，故又称“序列多态性”。②这一“序列多态性”在PKU患者和正常人中存在着连锁不平衡性，故可作为一种“遗传标记”应用于产前诊断。第38页，课件共69页，创作于2023年2月①PCR/ASO探针法和PCR-RFLP连锁分析法。②PCR/SSCP③直接测序法—若待诊断的PKU家系的基因突变类型尚属“未知”或无RFLP信息。（二）PKU的DNA诊断第39页，课件共69页，创作于2023年2月先合成ASO如： 正常探针： TCCATTAACAGTAAGAATTT 突变探针： TCCATTAACAATAAGAATTT利用PCR/ASO探针法诊断苯丙酮尿症第40页，课件共69页，创作于2023年2月利用PCR/ASO探针法诊断苯丙酮尿症▽◎△▲ ○◎△健康男性 ▽男性携带者

▲男性患者○健康女性 ◎女性携带者 ●女性患者●▽正常探针突变探针第41页，课件共69页，创作于2023年2月第三节肿瘤的基因诊断第42页，课件共69页，创作于2023年2月1 通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤 慢粒：（染色体易位）费城染色体 PCR检测融合基因

2 检测肿瘤相关基因癌基因（ras）、抑癌基因（p53）、肿瘤转移基因3 检测肿瘤相关病毒基因 HBVHCV－肝癌 EB－鼻咽癌4 检测肿瘤标志物基因或mRNA

肝癌—甲胎蛋白（AFP）结肠癌—癌胚抗原（CEA）肿瘤基因诊断的策略第43页，课件共69页，创作于2023年2月肿瘤标记物基因的检测着丝粒

染色体22bcrgenec-ablgene

染色体9

bcr-mRNA

bcr-abl

mRNA

染色体9,22

bcr-abl融合蛋白（具PTK活性）

慢性骨髓白血病

引物A引物B第44页，课件共69页，创作于2023年2月2 癌基因和抑癌基因的检测㈠ras癌基因的检测ras基因中最常见的点突变是第12，13或61密码子突变检测方法：PCR/ASOPCR-SSCP第45页，课件共69页，创作于2023年2月㈡p53的检测p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子130~290，以175、273、284最多见检测方法：PCR—SSCPPCR—测序PCR—RFLP第46页，课件共69页，创作于2023年2月㈢其它基因的检测PCR结合其它技术基因芯片第47页，课件共69页，创作于2023年2月4、肿瘤标志物检测或mRNA诊断肿瘤标志物 是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和发展相关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、同工酶等。基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）检测方法：PCR—ASOPCR—测序PCR—RFLPPCR－SSCP第48页，课件共69页，创作于2023年2月第四节感染性疾病的

基因诊断第49页，课件共69页，创作于2023年2月一、感染性疾病基因

诊断的策略针对病原体特异的核酸序列设计探针进行杂交应用PCR技术扩增病原体基因保守序列核酸杂交技术与PCR技术联合应用第50页，课件共69页，创作于2023年2月特点简便、特异、快捷能检测出潜在的病原体可对病原体进行分类、分型鉴定不能得知病原体进入体内后机体的反应第51页，课件共69页，创作于2023年2月二、基因诊断的感染性疾病（一）、病毒特点：分离培养—周期长，操作繁杂，制约因素多电镜观察—直观快速，但昂贵免疫学诊断—简便快速，但存在问题：不易检出潜伏期的病毒有些病毒亚型多，抗原变异性大整合进入人基因组的病毒第52页，课件共69页，创作于2023年2月病毒核酸分析技术HBV—包含4个开放阅读框，S、C、P、X PCR PCR/限制性内切酶谱分析 PCR/点杂交, PCR/Southernblot 基因芯片目的基因引物序列扩增片段C5’ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT3’425bp5’AGTGCGAATCCACACTC3’第53页，课件共69页，创作于2023年2月

调节和启动转录LTRgagpolenv

tat，revLTR

长末端重复序列调节蛋白基因正常的病毒基因产生病毒核心蛋白产生逆转录酶和整合酶

产生病毒外膜蛋白附加基因*HIV病毒基因组结构第54页，课件共69页，创作于2023年2月目的基因引物序列扩增片段env5’ACAATTATTGTCTGGTATAG3’135bp5’AGGTATCTTTCCACAGCCAG3’HIV-1ProbeTGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAGPCR/核酸杂交诊断艾滋病第55页，课件共69页，创作于2023年2月SARS——RT－PCR多重PCR荧光定量PCR第56页，课件共69页，创作于2023年2月（二）、细菌细菌性痢疾——志贺菌，侵袭性大肠杆菌，大质粒；PCR结核病——PCR

第57页，课件共69页，创作于2023年2月（三）、寄生虫重复序列探针法、寡核苷酸探针法、基因组探针法、PCR第58页，课件共69页，创作于2023年2月第五节基因诊断策略第59页，课件共69页，创作于2023年2月（一）检测致病基因突变基因变异致病的类型：内源基因的变异基因结构的突变点突变、插入、缺失、重排、异位基因表达异常mRNA剪接异常外源基因的插入第60页，课件共69页，创作于2023年