二氧化碳减排技术在微藻培养中的应用

二氧化碳减排技术在微藻培养中的应用

工业活动导致co含量的迅速增加。同时，高昂的温室效应也是全世界必须面临的危机。微藻所具有的独特生理特性为有效吸收CO2、解决温室气体难题提供了契机。作为一类具有极高光合效率的单细胞微生物,微藻不仅能够通过光合作用高效吸收CO2,而且可将其转化为蛋白质、油脂、多糖等多种生物活性物质成分,由此可望构建具有良好社会经济效益的新型减排技术。20世纪90年代初以来,螺旋藻已成为全球范围内产业开发最为成功的微藻。螺旋藻所展示的规模化产业、广泛有效的应用价值以及罕有的生理特性为建立CO2产业化减排技术提供了绝好的发展空间。然而,由于螺旋藻产业化生产仍采用简易低成本的开放池培养模式,所通入补充的CO2气体将会大量逸出和浪费,因此必须建立简易低成本的防逸装置,才能促进CO2减排技术的发展。尽管与淡水养殖螺旋相比,海水养殖螺旋藻可显著提高其品质,而且能节约大量的淡水资源,但目前螺旋藻的养殖还是以淡水养殖为主,主要原因是海水螺旋藻养殖的生产成本高。本实验室自20世纪80年代末至90年代初在国际上率先建立了全海水的螺旋藻产业化生产技术,但由于在培养过程中,高的pH生长环境使得无机碳源易与海水中的钙镁离子生成沉淀,大幅度增加了碳源成本,从而限制了其产业化的进一步推广。由于CO2的碳含量是小苏打(NaHCO3)的1.83倍,而且成本只有小苏打的一半左右,以CO2取代小苏打做为碳源能很好降低螺旋藻的生产成本。不仅如此,以补充CO2为碳源能有效的控制藻液的pH,有效减少海水钙镁沉淀的生成,这无疑也将大幅度降低海水螺旋藻的生产成本。如何通过控制CO2补充量以避免培养物的快速酸化所导致细胞的损伤,以及如何防止培养物中CO2的逸出泄露,是目前国际上高度关注并亟需解决的技术关键。本文结合微藻的pH漂移原理以及耐高碱的特性建立了耦合CO2减排的开放池培养应用技术,并将该技术初步应用于螺旋藻产业化培养,以解决螺旋藻培养成本过高的问题,为有效降低螺旋藻养殖成本、有力推进微藻低碳产业发展奠定基础。1材料和方法1.1海藻的筛选实验藻种为钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)和嗜碱绿球藻(Chlorococcumalkaliphilus,暂定名)MC-1株系。螺旋藻的全海水中试培养所用藻种为钝顶螺旋藻HS331藻株,该藻株为一新藻株,于2007年从三亚海王海洋生物科技有限公司(简称三亚海王公司)的海水螺旋藻养殖基地中筛选而得。MC-1由本实验室于2002年从室外蓝藻培养物中分离纯化而得。1.2培养基和材料MC-1实验室内的培养采用向文洲等的方法进行培养。HS331海水螺旋藻中试培养采用修改后的南海-II号培养基进行培养,培养基采用100%自然海水配置,在300m2的跑道池进行,所用海水从试验基地附近海域抽取,通过覆盖颗粒活性炭的砂滤池过滤。跑道池培养中的叶轮搅拌转速为13r/min,藻液流速为0.3m/s;培养物深度保持在20cm左右。螺旋藻产业化生产采用含10%-30%自然海水的培养基,补充70%-90%的自来水培养,扩种时培养基含1-2g/L小苏打,其它培养基成分与HS331的一致。CO2补充方法及减排技术:采用纯度为99.99%的食品级瓶装CO2,液态CO2经减压、气化后通入培养池底,经带微气孔的气石进入培养物。为防止CO2气体从培养物逸出泄露,在气头上方的培养物液面悬置一方形或长方形玻璃/铁皮箱结构的防逸罩,开口朝下,使补充后外逸的CO2汇集于气罩中。防逸罩的表面积随单个培养设施的面积不同而不同,水族箱为1.0cm2-2.0cm2,300m2跑道池为1.5m2,2500m2跑道池为3.0m2。1.3海藻细胞的培养户外螺旋藻生物量的测定采用干重法,记录每天的生物量浓度(g/L),产率按照下列公式计算:其中ΔC表示螺旋藻细胞生物量浓度(g/L)的日变化量,h(cm)表示藻池中培养液的深度。MC-1的生物量的以700nm下的吸光度表示(OD700),或者以干重表示(g/L)。1.4藻泥的采集和整理当螺旋藻培养物光密度OD700达到1.2-1.5时,采用300目尼龙筛绢过滤采收,清水冲洗至少3遍去除无机盐成分。海水中试培养时,将采收藻泥铺开并切成40mm×20mm×3.0mm大小的小片,晒干,密封保存。螺旋藻产业化生产中采用喷雾干燥。1.5重金属元素检测总蛋白含量采用凯氏定氮法测定。叶绿素和胡萝卜素测定采用文献的方法进行。藻胆色素测定按照文献的方法进行。每个样品的测定重复3次。重金属元素分子采用等离子光谱法分析,由广州分析测试中心协助完成。镉的参照标准为食品中污染物限量中华人民共和国国家标准(GB/16740-1997),砷、铅、汞的参照标准为保健(功能)食品(包括螺旋藻粉)通用中华人民共和国国家标准(GB/2762-2005)。1.6海藻干品含碳量的计算CO2成本分析按1300元/吨计。NaHCO3成本按2300元/吨计。螺旋藻干品的含碳量按50%计算。所用CO2浓度按100%计。广州市海怡康生物科技有限公司(简称广州海怡康公司)提供海水螺旋藻产业化养殖的产量及碳源消耗数据。1.7mc-1生长曲线测定除了将培养基中的NaHCO3的含量增加到3g/L,MC-1培养基的其他组分同文献。MC-1的初始接种量OD700为0.2,培养基pH通过HCl/NaOH调节到7.3,设置3个平行样,藻液置于500mL锥形瓶置于光照培养箱中培养(GXZ-268B),冷白荧光(PhilipsTl628W/885)光照,光强度为100μE/(m2·s1),培养温度为25℃,光照周期为14∶10(日/夜),培养一个周期(7天),每天固定时间记录MC-1的OD700以及pH值,做MC-1随时间的生长曲线以及pH漂移曲线。1.8测定藻液ph值MC-1的培养在户外50L的水族箱中进行,培养基同文献,藻液的初始生物量为0.515g/L,起始pH8.3,在随后的培养过程中,对照组通过加入NaHCO3将藻液pH控制在10.5以下,实验组以间断性的通入CO2气体将藻液pH值控制在9.0-10.0之间,设置3组平行,置于户外自然条件下培养,记录早、中、晚的光照强度、温度以及藻液的pH值,每天固定时间取20mL藻液测定干重,做MC-1随时间的生物量变化曲线。2结果2.1培养液ph的控制室内MC-1培养实验结果表明,当MC-1以NaHCO3为碳源进行光照培养时,培养液的pH值在一个培养周期内从起始7.3逐渐上升到了12.0左右(图1),即pH漂移现象。MC-1在较高pH水平下(9.0-11.0)的生长状态良好。在室外小试实验中,以间断性通入CO2的方式补充碳源能将藻液的pH控制在9.0-10.0之间,而仅补充NaHCO3的对照组,其培养液的pH只能控制在较高范围(10.2-10.5)。在以NaHCO3为碳源的对照组的培养末期,培养物底部有钙镁沉淀生成,而以CO2为碳源的实验组则无沉淀产生。经过11天的连续培养,CO2实验组和NaHCO3对照组藻液的生物量浓度从起始0.515g/L分别上升到1.224±0.030g/L和0.896±0.035g/L,CO2实验组累计生物量产量高出NaHCO3对照组86.08%(图2)。在CO2通入的初始阶段,已排除空气的防逸罩内所汇集的气体全部是CO2气体,在培养液的pH得以有效控制后,停止通入CO2气体。继续培养较长时间(约2h)后吸取防逸罩内的残余气体,经成分分析表明,罩内气体仅存在N2和O2。由培养物光合作用释放的氧气含量大约是氮气含量的2倍以及防逸罩内残余的CO2气体组分为0的分析结果表明,罩内汇集的CO2已被培养物完全吸收(图3)。2.2海藻干品的产率及碳源成本在300平米的开放跑道池中将前文中建立的CO2减排技术应用于海水钝顶螺旋藻HS331株系的中试培养,经过60天连续培养共生产了173.97kg的干藻,平均产率达到9.54g/(m2·d1),单日最高产率达到37.2g/(m2·d1)。每生产1.0kg螺旋藻干品比传统海水螺旋藻生产技术节约了5.2kg的NaHCO3,同时也消耗了0.76kg的CO2,每公斤干藻的碳源成本减少了57%以上(表1)。研究结果还表明,以耦合CO2的方式进行生产可完全避免海水培养物形成钙镁沉淀。2.3碳源成本降低表2所示,在三亚海王公司螺旋藻产业化生产中,耦合CO2生产工艺的年产量比传统工艺提高了20%;每生产一吨藻粉节约NaHCO34.16吨,但需额外补充CO21.07吨,总碳源成本降低了58%以上;传统生产工艺不能有效的控制培养液pH,最高值可达11.5。新生产工艺能将藻液的pH控制在10.0-10.3的范围,年消耗CO2约45吨。耦合CO2减排技术得到的螺旋藻产品的主要成分分析结果表明,螺旋藻的主要营养成分含量保持较高水平,重金属含量远低于国家限量标准(表3)。3讨论3.1ph保鲜、耐高碱、耐碱特性的藻种在利用微藻减排CO2的过程中,过多的吸收CO2可使培养物快速酸化,从而对藻细胞产生毒害作用,并导致溶液中的碳源以CO2的形式流失。根据酸碱平衡原理,CO2更易被碱性溶液所吸收,藻液的碱度越高,其对CO2的吸收效率越高,培养物的酸化速度越慢。一些微藻在生长过程中具有pH漂移的特性,其培养液的pH可随着藻的生长持续升高,这是由于这些微藻在利用碳酸氢根离子同时使得溶液中OH-离子含量增加。pH漂移所形成的高碱性培养液可以有效的吸收CO2,而且通过控制培养液中CO2的补充量可有效维持培养液pH的稳定,从而避免培养液的过度酸化。赖文亮等利用这一原理建立螺旋藻的CO2补充技术,使藻液的pH保持在8.5-9.7范围内,单位面积产率可达9.1gDW/(m2·d1)。因此具有耐高碱和pH漂移特性的藻种在CO2减排中将独具优势。本实验室通过对硅藻MD-1的研究也论证了藻种的高碱、高pH适应性以及pH漂移特性对CO2减排的重要生理作用。本实验室早先分离的MC-1藻种是目前文献所记载pH漂移最快、适应碱性极强的微藻(图1)。因此,利用MC-1这一典型特性,建立了室外小体积的CO2补充(减排)技术(图2),并构建了简易有效的CO2防泄露装置,可使藻液中逸出的CO2能被碱性培养物完全吸收(图3)。由于螺旋藻和MC-1在生理特性的高度相似性,即它们在CO2减排原理上的一致性,本研究成功将该技术应用于螺旋藻的中试培养和产业化生产。3.2氮原素co-pa与法金属元素nahco3的相互作用在没有建立CO2补充装置以前,三亚海王公司的螺旋藻生产因藻液的pH漂移过高导致不能长时间持续生产,平均每4个月需重新扩种一次,造成了肥料的大量浪费。采用本研究的CO2补充技术以后,不仅有效的替代了NaHCO3碳源,而且使藻液pH得以较好地控制,培养基可以全年循环使用,碳源成本大幅度降低,螺旋藻产量也得以明显提高(表2)。更为重要的是,采用该技术可获得优质的螺旋藻藻粉,其主要营养成分含量均保持在较高水平(表3)。同时,螺旋藻的铅、砷、汞元素含量也非常低,远低于国家保健(功能)食品重金属元素的限量标准(表3),镉元素含量也低于大量食用的普通食品的标准,这4种元素还低于该公司在建立CO2补充技术以前合格产品的重金属元素含量(结果未给出)。因此本研究结果表明,以CO2取代NaHCO3可能有效地减少了螺旋藻对重金属的富集。近来,螺旋藻等食品的重金属含量及标准问题得到了社会上的高度关注和广泛争议,因此本研究建立耦合CO2减排的优质、高产、低成本的培养技术,对更好地发展螺旋藻产业具有重要意义。3.3耦合co减排的海水藻业应考虑的问题尽管本研究通过耦合CO2补充技术节省了螺旋藻产业化生产中58%以上的碳源成本,但与理论值相比,还有较大差距。按干藻粉50%的碳含量估算,每千克干藻粉的碳源(CO2)理论生产成本为1.47元,可本研究的实际生产成本为5.99元(表2)。可见,该技术还有更大的优化空间。本研究产业化应用效果与理论上的差距主要来自两个方面:一方面,扩种阶段仍然以NaHCO3为主要碳源。另一方面,由于藻池的培养面积大(2500m2),目前所设计的CO2补充装置较小,在产业化培养过程中只能将藻液的pH的控制在10.0-10.3左右。与此相对应的是,海水螺旋藻HS311株系的中试培养因pH控制在9.3-9.7之间,所获得的产率比产业化生产高出近一倍(表2)。由于中试实验在实施期间,正值雨水台风多发期,能够获得这样的产量表明了HS311为一株优良的海水藻种。将pH控制在更低的水平将会进一步的节省成本,或更有利于生长,但过低的pH会导致CO2泄露并失去对敌害生物的控制。因此,我们认为在耦合CO2减排的螺旋藻产业化培养中,pH应控制在9.0-9.5范围为宜。如何通过改善CO2补充装置、优化扩种阶段的NaHCO3用量,从而更好地减少碳源用量或碳源成本,还有待进一步深入研究。