产油微藻的筛选及鉴定

产油微藻的筛选及鉴定

随着岩浆岩能源的日益稀缺，作为一种可替代能源，生境源受到了广泛的关注。生物柴油因在能源密度、燃烧性能方面与化石柴油具有极高的相似性且具有环境友好、可再生等优点,而被认为是解决能源危机的最好替代能源之一。以提取法从油类作物、地沟油和动物脂肪中获得的生物柴油虽然具有众多优点,但是这些原料的来源十分有限,远不能满足人类社会发展的需要。进行微藻的大规模培养被认为是解决生物柴油原料问题的最具潜力的途径。在过去的十多年里,美国、意大利、英国和日本等发达国家已相继开展微藻培养和生物柴油制备等工作,国内的中国科学院、清华大学、北京大学、中国海洋大学、新奥集团和中石化等一些机构也正在积极开展这方面的研究,能源微藻的研究炙手可热。然而,现阶段进行微藻柴油的规模化生产,还存在许多技术瓶颈。要解决这些技术瓶颈需要折中和糅合微藻代谢调控及藻种筛选等各种因素。发展能源微藻项目的第一步无疑是解决藻种问题,筛选油脂高产藻种时,同时要注意微藻生长速度、对当地气候的适应能力以及在进行大规模培养时的经济效益等因素。本文进行了产油微藻的分离和筛选方面的工作。从不同水域获取多份水样,建立了一套藻种分离方法,获得了多株产油微藻。研究了这些藻种在自养和异样条件下的产油情况,并对其中高产藻种进行了种类鉴定。1材料和方法1.1采样本实验使用的水样采自江南大学校园内外几条污水沟及无锡太湖水域。采集水样用塑料瓶装好,带回实验室进行分离纯化。1.2藻种异养的培养藻种的自养培养和分离纯化过程中采用BG11培养基;去除BG11培养基中的碳酸钠,加入15g/L的葡萄糖作为藻种异养培养的培养基。培养基初始pH均调到6.5左右,添加2%的琼脂粉制备对应的固体培养基。1.3培养时间及培养温度自养培养:以培养至对数生长期的藻液为种子培养液,以10%(V/V)接种量接种于BG11培养基中,置于光照强度为3600lux、12h∶12h光照黑暗循环、培养温度23±1℃的光照培养箱中培养20d。自养培养时每天摇晃培养液3~5次。异养培养:以培养至对数生长期的藻液为种子培养液,以10%(V/V)接种量接种于添加葡萄糖作为唯一碳源的BG11培养基中,置于转速为150r/min、温度为23±1℃、无光照的摇床中培养7d。1.4单藻落的制备将采集的水样先用纱布过滤除去大型颗粒物,滤液4000r/min离心20min。弃去上清液,加入10ml的BG11培养基,振荡使藻细胞悬浮,适当稀释后取0.1ml涂布于固体平板。培养20d后,用接种环挑出单藻落,将藻体转到装有2ml培养基的广口小试管中,于光照培养箱中培养。15d后取长势良好的藻液进行多次平板涂布和划线纯化,最后将纯化的藻种进行保存。1.5藻株的初步鉴定藻种形态观察与初步鉴定:用光学显微镜进行拍照观察,参照《中国淡水藻类——系统、分类和生态》进行藻株初步鉴定。藻种分子生物学鉴定:将已分离纯化的单藻落平板,送到生工生物工程(上海)有限公司进行18srDNA测序,将得到的结果提交Genbank中进行Blast序列比对,基于MEGA软件进行多重序列分析,并构建系统发育树。1.6藻粉油脂提取方法微藻生长曲线的测定:采用紫外可见分光光度仪测定藻悬液在680nm处的吸光值(OD680)。微藻生物量的测定:取4ml稳定期的藻悬液于已称重的5ml的离心管中,8000r/min离心5min,倒去上清液,蒸馏水振荡洗涤2次后倒去上清液,然后将藻体在60~80℃的烘箱中烘干至恒重。称重。油脂提取方法:称取经低温冷冻干燥的藻粉0.3g,置于50ml的离心管中。加入8ml4mol/L的HCl,振荡器振荡均匀后,静置35min。然后沸水浴12min,接着迅速放入-20℃冰箱中,冰冻10~30min。取出离心管加入2倍体积氯仿甲醇(v/v,1∶1)提取剂,充分振荡,浸提20min。接着4000r/min离心20min后,取氯仿层(下层)于另一支离心管,加等体积的0.15%NaCl溶液,4000r/min离心20min取氯仿层(底层)于已称重的100ml的锥形瓶中。将瓶子放在60~80℃烘箱中烘至恒重。称重,计算油脂含量。油脂含量的测定:油脂含量=(油脂质量/藻粉干重)×100%单位时间和体积的油脂产率的计算公式如下:x=m1×n1−m0×n0tx=m1×n1-m0×n0t公式中:m1为培养结束时藻体生物量,m0为接种时藻体生物量,n1为收获时藻体的油脂含量,n0为接种时油脂含量,t为培养时间,x代表油脂产率。2结果与分析2.1小球藻、小环藻、绿球藻和小球藻微藻的形态特征从采集的水样中分离纯化出14株藻株,以微藻的显微照片及其生长特征为依据,参照《中国淡水藻类——系统、分类及生态》,将这些微藻初步鉴定为小球藻、栅藻、脆杆藻、小环藻和绿球藻。其藻种编号、采样地点和培养特征等见表1,藻株形态见图1。根据表1可知,不同藻株的藻落形态与颜色有一定差异,藻的沉降程度也因藻株而异。从图1中可看出,栅藻属藻种细胞以群体形态存在,小球藻、小环藻、脆杆藻细胞以单细胞状态存在。2.21藻体生长情况的影响在相同的自养和异养条件下,对14种微藻进行分批培养,自养条件每两天测一次OD值,异养条件每天测一次OD值,根据OD值作微藻的生长曲线。藻种的生长曲线如图2a、2b和图3a、3b所示(藻种Y13和Y14在自养培养或异养培养过程中生长缓慢未测定)。从图2中可以看到12种藻在16d左右生长速度放缓,在16到20d内12种藻OD值并没有表现出下降的趋势,为了便于分析,选择第20d收获藻体,测生物量并进行油脂提取。从图3中可以看到在异养条件下藻的生长周期相对于在自养条件下明显缩短,OD值明显增加;且大部分藻在4到5d内进入稳定期,选择第7d收获藻体,测生物量并进行油脂提取。对图2与图3对比可知,异养培养较自养培养周期明显缩短,且稳定期的OD值有显著提高,以藻株Y06为例,其异养稳定期的OD值是自养稳定期OD值的6倍多。2.3藻株的油脂含量如图4、图5所示,比较了12种微藻在自养和异养条件下的生物量及油脂含量。从图4可知,在自养条件下,12种藻株的生物量为0.97~1.73g/L,藻株Y06生物量最大为1.73g/L;在异养条件下,12种藻株的生物量为3.57~8.39g/L,藻株Y08的生物量最大为8.39g/L,藻株Y06的生物量为7.5g/L。根据图5可知,自养条件下,12种藻株油脂含量为7.15%~16.71%,藻株Y10的油脂含量最高为16.71%,藻株Y06油脂含量为12.08%,藻株Y08的油脂含量为8.43%;异养条件下,12种藻株油脂含量为8.53%~21.22%,藻株Y09的油脂含量最高为21.22%,藻株Y06的油脂含量为20.87%,藻株Y08的油脂含量为8.53%。结合生物量和油脂含量可知,藻株Y06相对于其他藻株具有较好的产油潜力。2.41藻株在自养和异养条件下的油脂产率及收获量利用生物量或总脂含量作为产油藻株的评价标准较为片面,据此引入油脂产率和油脂产量作为重要的参考指标。如表2所示,比较了12种微藻在自养条件和异养条件下的油脂产率和油脂收获量。从表中可知,自养条件下,12种藻株的油脂产率为3.46~9.40mg/L·d,油脂产量为0.09~0.19g/L;异养条件下,12种藻株的油脂产率为69.96~201.29mg/L·d,油脂产量为0.49~1.41g/L。藻株Y06在自养和异养条件下都具有最高的油脂产率和油脂产量,其在异养条件下的油脂产率为201.29mg/L·d是自养条件下9.40mg/L·d的21.41倍;在异养条件下的油脂收获量为1.41g/L是自养条件下0.19g/L的7.42倍。因此,选定藻株Y06作为最具有产油潜力的微藻。2.5系统进化分析对藻株Y06进行18SrDNA测序,序列长1633bp,与Genbank中现有的多个栅藻序列的相似度达到99%,其与Scenedesmusabundans(X73995.1)的相似度最高。从GenBank数据库中选6株同源性相近的栅藻与藻株Y06一起构建系统进化树,结果见图6。其中藻株Y06与Scenedesmusabundans聚为一簇,靴带支持率高达100%,确定藻株Y06为栅藻属(Scenedesmusabundans)。3生物柴油藻种的产油性能本文建立了一套藻种分离方法,从自然界水体中共分离纯化出14种藻株。同时对各藻株在自养和异养条件下生长情况做了初步研究,并以藻株在两种不同条件下的的油脂产量和产率作为最重要的筛选条件,从中筛选出藻株Y06进行了种属鉴定。根据藻株Y06的细胞形态特征,并结合藻株的18SrDNA分子生物学鉴定,确定藻株Y06为栅藻属(Scenedesmusabundans)。藻株Y06在自养条件下油脂产率为9.40mg/L·d油脂产量为190mg/L是Mandal等对生物柴油藻种Scenedesmusobliquus进行自养培养30d获得的油脂产量53mg/L的3.58倍;藻株Y06在异养条件下的油脂产率为201.29mg/(L·d)油脂产量为1.41g/L,是黄冠华等对小球藻进行条件调控培养14d后得到最高脂肪酸总产量1.04g/L的1.3倍,是Mandal等对生物柴油藻种Scenedesmusobliquus进行异养培养10d获得的油脂产量0.586g/L的2.4倍。可见,藻株Y06具有较好的产油潜力;同时该藻还具有容易培养、藻体易于收集和生物量大等优点,藻株Y06可以作为下一步代谢调控优化等研究的候选藻种。针对微藻生产中成本过高的问题,国内外许多学者提出利用污水培养微藻,污水深度处理与生物柴油生产