玻璃化与包埋玻璃化超低温保存怀地黄‘85-5’带芽茎段的效果比较

玻璃化与包埋玻璃化超低温保存怀地黄‘85-5’带芽茎段的效果比较

怀孕地黄是玄参科地黄的一种多年生草本植物植物。这是著名的“四种怀孕药”之一。关于怀地黄的研究,目前主要集中在大田栽培、组织培养、病毒病检测和脱毒快繁等方面,而其种质资源的保存则主要采用田间种植法,耗费大量人力物力且易受自然灾害的影响。越来越多的研究表明,超低温保存是长期保存植物种质资源的理想途径,该方法已经成功地应用于甘蔗(简令成等,1987)、甘薯(Hirai&Sakai,2000)、紫罗兰(Shiblietal.,2004)等多种植物种质资源的保存。玻璃化法和包埋玻璃化法是20世纪90年代前后发展起来的两种超低温保存新方法(裴冬丽等,2005),薛建平等(2003)对怀地黄的玻璃化超低温保存进行了研究。作者进一步比较了玻璃化和包埋玻璃化超低温保存的效果,以期为建立怀地黄种质资源的超低温保存技术体系奠定基础。1材料和方法1.1试苗的培养材料为河南师范大学四大怀药研究室培养的怀区(河南温县、武陟等地)地黄主栽品种‘85-5’无菌苗。将在MS+蔗糖30g·L-1+6-BA0.2mg·L-1+NAA0.02mg·L-1培养基上常温培养40d的试管苗置于冰箱中4℃低温锻炼5d,以常温培养的为对照。切取低温锻炼的和对照两种材料的带芽茎段(10mm左右),均分别转入MS+蔗糖0.3mol·L-1+6-BA0.2mg·L-1+NAA0.02mg·L-1(1号)和MS+蔗糖0.4mol·L-1+DMSO50g·L-1+乙酰胺10g·L-1(2号)两种预培养基,于4℃冰箱中预培养3d。1.2带芽茎段的材料预培养后将材料再切成2mm左右的带芽茎段。将用于包埋玻璃化法保存的材料与含褐藻酸钠30g·L-1的MS培养液悬浮混合,然后将混合液滴入含氯化钙0.1mol·L-1的MS培养液中,每滴含有1个带芽茎段,常温下固定30min。玻璃化法保存的材料不包埋。两种方法保存的材料均单独使用两种装载液,A:MS+甘油184g·L-1+蔗糖0.4mol·L-1;B:60%PVS2(MS+甘油180g·L-1+乙二醇90g·L-1+DMSO90g·L-1)室温过渡25min,然后用PVS2(MS+甘油300g·L-1+乙二醇150g·L-1+DMSO150g·L-1)(Sakaietal.,1990),0℃下脱水30min或60min,或室温脱水30min。每10个茎段装入1个冷冻管,注入1mL预冷的PVS2后立即投入液氮保存。1.3再生生物量和存活率材料在液氮中保存1d后,迅速取出并于40℃水浴中快速化冻1~3min,用含1.2mol·L-1蔗糖的MS培养液室温下洗涤2次,每次10min。一部分用TTC法(简令成等,1987)检测存活率;另一部分再生培养(培养基为MS+6-BA0.3mg·L-1+NAA0.02mg·L-1+GA30.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1),先暗培养7d,再转至光下培养4周,统计再生率(超低温保存后生成再生苗的茎段数/接种的总茎段数×100%)。试验重复3次,每20个茎段为一个重复。应用SPSS11.5统计软件分析试验数据,t检验比较差异显著性。2结果与分析2.1材料存活率和再生率由表1可以看出,低温锻炼5d与不进行低温锻炼相比,两种方法超低温保存的材料存活率和再生率的差异都达到极显著水平。两种方法相比,玻璃化法的存活率和再生率均高于包埋玻璃化法。可见,低温锻炼有利于超低温保存,且对玻璃化超低温保存有更大的影响。2.2两种超低温方法所需植株的再生率低温锻炼5d后,1号预培养基培养的材料经两种超低温方法保存后再生率均为0。如表1所示,用2号预培养基培养的材料经两种超低温方法保存后均获得了再生植株。可见,预培养基对超低温保存后的效果有极显著的影响。2.3玻璃化法载液a装无论哪种装载液处理,玻璃化法均优于包埋玻璃化法。用装载液A装载,玻璃化法保存的存活率和再生率分别是包埋玻璃化法的2倍和21.31倍;用装载液B装载,前者的存活率和再生率分别是后者的1.4倍和3.58倍(表2)。2.4包埋玻璃化法的再生性能在其它步骤最优的条件下,用PVS2脱水30min,25℃时,玻璃化法和包埋玻璃化法保存后再生率均为0;0℃时,材料的再生率均得到极显著提高,玻璃化法的平均再生率为59.03%,包埋玻璃化法的平均再生率是20.84%。用PVS2在0℃下脱水的时间不同,超低温保存后的效果也不同。玻璃化超低温保存中脱水30min的最高再生率(64.29%)远高于脱水60min的(16.67%),前者是后者的3.86倍;包埋玻璃化超低温保存中脱水30min的最高再生率(26.67%)是脱水60min(3.33%)的8.01倍。可见,脱水温度和时间对超低温保存后的效果有显著的影响。玻璃化超低温保存的材料经化冻、洗涤后,在再生培养基上培养10d开始萌动(图1,A),再培养40d长成再生植株(图1,B)。3超低温保存株的制备及再生率Carmen和Elena(2005)超低温保存菊花时低温锻炼3d,李明军等(2006)玻璃化超低温保存怀山药种质时低温锻炼7d,均取得了较好的效果。本试验中也发现低温锻炼5d能显著提高怀地黄保存后的再生率。可见适当的低温锻炼有利于提高超低温保存后的效果。合适的预培养基有助于超低温保存的成功。王家福等(2006)用玻璃化保存枇杷茎尖表明,在含DMSO50g·L-1、6-BA2mg·L-1和蔗糖50g·L-1的MS培养基上预培养5~7d为好;本试验结果也表明,4℃条件下怀地黄茎段在添加DMSO50g·L-1、蔗糖0.4mol·L-1、乙酰胺10g·L-1的MS培养基内预培养3d效果较好。Eleysen等(2005)超低温保存刺槐时采用MS添加蔗糖和甘油作为装载液,李明军等(2006)玻璃化超低温保存怀山药时采用60%PVS2作为装载液,本试验通过两种方法超低温保存怀地黄采用60%PVS2作为装载液时,均有利于提高材料保存后的存活率。可见,用适宜的装载液过渡对超低温保存是必要的。试