金藻基因组dna提取方法的研究

金藻基因组dna提取方法的研究

大多数金属藻没有完整的毛囊，富含脂肪酸和营养价值。这是中国水产养殖的优质饲料，但也有一些品种能形成赤潮，严重损害了中国的水产养殖和水环境。我国常见的金藻以巴夫藻属、等鞭金藻属和棕囊藻属的种类为主,其中前两个属的种类是我国水产养殖的常用优质饵料,棕囊藻属的种类是我国赤潮的常发生种,它们与我国水产养殖和水域环境关系密切。近年来有关金藻的营养、饵料价值研究较多,但是有关其系统学研究的报道较少,使用方法主要以传统的形态分类为主。由于金藻在保存和培养时形态特征容易发生变化,且部分分类标准易受外界环境的影响等,故目前金藻的分类系统比较混乱。随着分子生物学的发展,应用基因或DNA序列进行分子系统学分析,为金藻分类系统的重建提供了有力的理论依据。基因组DNA的提取是获得基因或DNA序列进行系统发育分析的前提,直接决定着PCR扩增、酶切、克隆等实验的进行,因此,寻找一种快速、简便、廉价的获得高质量基因组DNA的DNA提取方法,对于金藻分子领域研究的广泛开展非常必要,并且目前有关金藻DNA提取的文章也非常少。本文以金藻类饵料藻类绿色巴夫藻和赤潮藻类球形棕囊藻作为研究金藻DNA提取方法的实验对象,并以叶绿体光合作用PSⅡ反应中心复合物(D1-D2-Cy559)的D1(32KD)蛋白的编码基因——psbA基因的PCR扩增效果对不同方法提取的基因组DNA进行检测,以期为我国金藻类分子系统学研究工作的开展做好前期准备工作,同时也希望能够获得一种快速、简便、高效的DNA提取方法。1材料和方法1.1多样性系藻种室球形棕囊藻(Phaeocysitisglobosa)由香港大学生物多样性系藻种室提供,采自香港将军澳水域。绿色巴夫藻(Pavlovaviridis)来自暨南大学水生所藻种室。藻种采用F2培养基进行培养,培养温度为20℃,光照强度为4000lux,光暗比为12h∶12h。1.2样品处理和纯化DNA提取的藻液为实验室培养的等量新鲜藻液。为区分起见,4种DNA提取方法分别命名为高盐法、PVP法、玻璃粉法和CTAB法。其具体步骤如下。(1)高盐法:参考Salah等的方法,并做部分修改。藻液经过离心浓缩后,加入400μLSDS(十二烷基磺酸钠)提取缓冲液(0.2mol/LTris-HClpH值8.0,25mmol/LEDTApH值8.0,0.25mol/LNaCl,0.5%SDS)和8μL20mg/mL的蛋白酶K,55°C水浴2h,离心后,上清加入300μL的6mol/LNaCl,摇均,10000r/min离心30min,上清加入等体积的异丙醇,-20°C沉淀1h以上,沉淀用70%的酒精冲洗两次,无水乙醇洗一次,室温下晾干,加入50μLTE溶液溶解。-20°C保存,备用。(2)PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)法:参考Kim等的方法,并做部分修改。前期步骤如(1),样品经SDS提取缓冲液消化离心后,上清加入200μL10%的PVPk30和0.5倍体积的7.5MNH3Ac,冰浴30min,10000r/min离心10min,上清加入等体积的异丙醇,-20℃放置30min,10000r/min离心10min,沉淀用70%的酒精冲洗两次,无水乙醇洗一次,室温下晾干,加入50μLTE溶液溶解。-20℃保存,备用。(3)玻璃粉法:为本实验室的藻类DNA提取方法,通过CTAB提取缓冲液裂解释放出DNA,再用凝胶纯化试剂盒纯化DNA。具体操作见文献。(4)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法:将高盐法的SDS提取缓冲液换成4×CTAB提取缓冲液(4%CTAB,0.1mol/LTris-HClpH值8.0,0.02mol/LEDTApH值8.0,1.4mol/LNaCl),提取过程与高盐法相同。1.3pcr反应体系及条件以psbA基因的PCR扩增效果对4种DNA提取方法进行检测,psbA基因的PCR扩增引物见文献。4种DNA提取方法获得的DNA都以50μLTE溶液溶解,实验时稀释10倍。PCR反应在UNOⅡBiometra仪上进行,25μL反应体系中含10×PCRBuffer[0.2mol/L(NH4)2SO4,0.75mol/LTris-HClpH值8.8,0.1%Tween20](MBI)2.5μL,25mmol/LMgCl2(MBI)2.5μL,dNTP(Takara)2μL,引物为1.0μmol/L,DMSO(北京鼎国生物有限公司)4μL,TaqDNApolymerase(MBI)1U,1μL模板(1∶10)DNA,其它用灭菌蒸馏水补足。PCR反应条件为,94℃变性5min;然后35个循环,每个循环为,94℃30s,55℃45s,72℃1min30s,最后72℃延伸10min。1.4检测dna基因组DNA和PCR扩增产物用0.7%的琼脂糖凝胶电泳,100V电压电泳,溴化乙锭(EB)染色,用凝胶成像系统观察并照相。2结果2.1不同方法提取的基因组dna条带4种DNA提取方法对球形棕囊藻和绿色巴夫藻基因组DNA提取结果如图1,由图可以看出,高盐法和PVP法对两种藻的提取效果相当,在大约20Kb处都有一条清晰的基因组DNA带,同时在点样孔内也残留着大量的DNA,拖尾现象也较明显,由此可见,这两种方法提取的DNA虽然产量高,但杂质含量也较多。玻璃粉法和CTAB法提取的基因组DNA条带较前两种方法的弱,但点样孔内残留的DNA少,且拖尾现象也不明显,因此,后两种DNA提取方法较前两种方法提取的DNA产量低,但杂质含量少,纯度高,玻璃粉法效果尤为明显,基因组带只在20Kb处有一亮带。从藻种而言,后两种DNA提取方法存在一定的差异性,总体以球形棕囊藻的提取效果好于绿色巴夫藻。2.2psba基因的pcr扩增效果psbA基因的PCR扩增结果如图2,由图可以看出,4种DNA提取方法提取的DNA对绿色巴夫藻psbA基因的PCR扩增都有较好的扩增效果,在靠近1Kb处都有一条清晰的特异性扩增条带,且不同方法间差异不明显。但是,对球形棕囊藻而言,不同方法间差异较大,其中以改良CTAB法提取DNA的PCR扩增效果最好,其次为高盐法和CTAB法,PVP法提取的DNA没有发现特异性扩增条带。3分析与讨论3.1dna分离方法的比较球形棕囊藻和绿色巴夫藻虽然都是金藻门藻类,但是两者的结构组成和营养生理却差别较大,它们是金藻门群体和单细胞藻类的典型代表。棕囊藻生活史复杂,地理差异明显,有单细胞和群体两种形态,并且单细胞又分为游动细胞和不动细胞,最主要的是群体内每个细胞都能产生光合碳,并最终合成粘质多糖,整个群体多糖含量高,并且在条件恶劣的情况下还能产生溶血素等有毒物质,因此,棕囊藻除了多糖含量高外,其它次生物质含量也较丰富。然而,绿色巴夫藻是一种单细胞微小金藻,藻细胞无细胞壁,能运动,不饱和脂肪酸含量高。球形棕囊藻和绿色巴夫藻生物学特性上的差异性必定会导致两者在DNA提取上的差异性。在DNA提取结果中,尤其是在玻璃粉法和CTAB法两种方法中,球形棕囊藻明显好于绿色巴夫藻。SDS和CTAB两种提取缓冲液在裂解细胞、释放DNA的原理和效果上,本身存在明显的差异。SDS主要是与蛋白质结合,使蛋白质变性,破坏细胞膜,使细胞基因组DNA释放出来,并且在高盐浓度下将DNA和蛋白质分离;CTAB能有效的裂解植物的细胞壁,但是对破坏细胞膜效果差,所以一般情况下必须与能使蛋白质变性,破坏细胞膜的蛋白酶K或酚-氯仿结合使用,然而,它的优势是CTAB在高盐浓度(>0.7mol/LNaCl)的情况下与DNA结合,从而使DNA与非DNA物质,如多糖物质、酚类物质等次生物质分离开来,因而获得的DNA较纯。因此,SDS提取缓冲液通常对不含细胞壁或次生物质含量较少的细胞裂解效果较好;而CTAB则对含细胞壁和多糖类细胞裂解效果佳。从DNA提取实验结果可以清楚的看到,以SDS提取缓冲液作为裂解液的方法,如高盐法和PVP法,提取的DNA总量都比以CTAB缓冲液作为裂解液的方法(CTAB法和玻璃粉法)高,但是以CTAB缓冲液作为裂解液的方法提取的DNA较纯;比较高盐法和CTAB法可以发现,虽然两者都是利用高盐(6mol/LNaCl)来分离DNA,但前者用的是SDS提取缓冲液,而后者用的是CTAB提取缓冲液,最后高盐法对两种藻提取的基因组DNA的量明显高于CTAB法;比较同以CTAB缓冲液作为裂解液的玻璃粉法和CTAB法两种方法可以看出,CTAB法由于只使用了蛋白酶K辅助裂解细胞,而玻璃粉法除了使用蛋白酶K外还使用了酚-氯仿抽提,最后玻璃粉法提取基因组DNA的量明显高于CTAB法。由此可见,SDS提取缓冲液对两种藻的裂解能力明显强于CTAB提取缓冲液,并且CTAB提取缓冲液与蛋白酶K和酚-氯仿结合使用效果较好。以SDS提取缓冲液作为细胞裂解液的高盐法和PVP法的最大优点就是在整个实验中都避免了与有毒物质的接触,操作安全、简单。高盐法采用的是6mol/LNaCl饱和溶液,而PVP法用的是10%的PVPk30和7.5mol/LNH3Ac,原理都是利用高盐浓度沉淀去除蛋白质等杂质,从而分离出DNA。PVP法除了使用类似于高盐法中的NaCl饱和溶液的NH3Ac饱和溶液,还多加了一种高分子化合物PVP,PVP是一种高分子合成树脂,可溶于水、乙醇及氯仿,工业上常用作澄清剂、稳定剂,能络合多酚类物质,防止多酚物质氧化成醌类,具有抗氧化作用。从DNA提取结果来看,两种方法对两种藻类DNA的提取效果差别不明显,但从PCR反应来看,高盐法效果更好。可见,在分离DNA的时候用同为单价离子的弱酸弱碱盐代替强碱强酸盐,并加入澄清剂PVP来提高DNA纯度的效果不大。玻璃粉法以CTAB缓冲液作为提取液,通过蛋白酶K和酚-氯仿来提高对藻细胞的裂解,促进DNA的释放,利用玻璃粉结合DNA的方法来分离纯化DNA,取得了显著的效果。玻璃粉法对两种藻类提取的DNA量比CTAB法有明显的增加,并且纯度在4种方法中也是最高的。就不同藻类DNA的提取效果来看,以球形棕囊藻效果最好,无论在纯度还是量上都取得了成功。由此可见,玻璃粉法对于糖类和胶质等次生物质含量较多的棕囊藻DNA提取是非常有效的。3.2pcr扩增和dna提取方法的影响从psbA基因的PCR扩增结果可以看出,对于绿色巴夫藻,不同DNA提取方法获得的DNA对psbA基因都有较好的特异性扩增。对于球形棕囊藻,则以玻璃粉法提取的DNA对psbA基因的PCR扩增效果最好,其次为高盐法,CTAB法提取的DNA只有微量的扩增,PVP法则未见有扩增条带。这可能与DNA的浓度和纯度有关,棕囊藻由于多糖等次生物质较多,并且SDS虽然裂解能力较强,但是对多糖等去除效果较差,实验过程中也发现,用TE溶液溶解的DNA溶液粘度较大,可见其糖类物质含量较高,这可能直接影响到了PCR的扩增效果。然而,绿色巴夫藻由于无细胞壁,多糖类物质含量也较少,因此,其提取DNA的PCR扩增效果较好。至