葡甘聚糖酶高产菌株Q1发酵条件优化及酶的分离纯化-王强(常用版)

葡甘聚糖酶高产菌株Q1发酵条件优化及酶的分离纯化_王强（常用版）(可以直接使用，可编辑完整版资料，欢迎下载）

葡甘聚糖酶高产菌株Q1发酵条件优化及酶的分离纯化_王强葡甘聚糖酶高产菌株Q1发酵条件优化及酶的分离纯化_王强（常用版）(可以直接使用，可编辑完整版资料，欢迎下载）·86·2021Vol.35No．5SerialNo．291ChinaBrewingResearchReport葡甘聚糖酶高产菌株Q1发酵条件优化及酶的分离纯化王2强1，，李22222旭3，张旭姣1，，张庆芳1，，窦少华1，，金连豆1，，迟乃玉1，*（1.大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连116622；2.辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁大连116622；3.大连市生产力促进中心，辽宁大连116025）摘要：该研究以海洋来源的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Q1为出发菌株，通过单因素实验对葡甘聚糖酶产生菌Q1发酵条件进行优化，并将菌株Q1发酵所得上清液经硫酸铵沉淀、透析、超滤离心和SephadexG-100凝胶过滤层析，得到电泳纯的葡甘聚糖酶，并研究其部分酶学性质。结果表明，最佳发酵条件为魔芋粉添加量0.75%、牛肉膏添加量为0.2%，蛋白胨添加量为0.4%、氯化钠添加量0.4%、培养温度26℃、转速160r/min、接种量5%、初始pH7.0、装液量100mL/250mL。在此条件下，葡甘聚糖酶酶活为241.61U/mL。葡甘聚糖酶相对分子质量为41.3ku；酶最适作用底物为葡甘聚糖。关键词：葡甘聚糖酶；发酵条件；优化；分离纯化中图分类号：TQ925文章编号：0254-5071（2021）05-0086-06Optimizationoffermentationconditionsofhighglucomannanase-producingstrainQ1andseparationandpurificationoftheenzymeWANGQiang1,2,LIXu3,ZHANGXujiao1,2,ZHANGQingfang1,2,DOUShaohua1,2,JINLiandou1,2,CHINaiyu1,2*(1.CollegeofLifeScienceandTechnology,DalianUniversity,Dalian116622,China;2.LiaoningTechnologyofMarineMicrobiologicalEngineeringResearchCenter,Dalian116622,China;3.DalianProductivityPromoteCenter,Dalian116025,China)Abstract：UsingBacillussubtilisQ1frommarineasoriginalstrain,thefermentationconditionsoftheglucomannanase-producingstrainQ1wereop-timizedbysinglefactorexperiments.Theglucomannanasefromthesupernatantliquorwaspurifiedusingammoniumsulfateprecipitation,dialysis,ultrafiltrationandgelfiltrationchromatogramofSephadexG-100,anditsenzymaticpropertieswereresearched.Theresultsshowedthattheoptimumfermentationconditionswereasfollows:konjakuflour0.75%,beefextract0.2%,peptone0.4%,sodiumchloride0.4%,culturetemperature26℃,rotatespeed160r/min,inoculum5%,initialpH7.0,liquidvolume100ml/250ml.Undertheconditions,theenzymeactivitywasupto241.61U/ml.Therelativemolecularmassoftheglucomannanasewasdeterminedtobe41.3ku.Theoptimumsubstrateoftheenzymewasglucomannan.Keywords：glucomannanase;fermentationconditions;optimization;separationandpurification葡甘聚糖酶（glucomannanase）是一种能将葡甘聚糖葡甘聚糖是魔芋的主要成分，降解为葡甘低聚糖的外泌酶。由甘露糖和葡萄糖单元按1.6∶1.0的摩尔比通过β-1,4-糖苷键相连的天然多糖高分子[1-2]。葡甘低聚糖是由葡萄糖和甘露糖组成的杂聚寡糖，最初从酵母的细胞壁中提取获得[3]。生物酶法降解葡甘聚糖可通过两种途径：一种是采用微生物代谢产生的葡甘聚糖酶酶解；另一种是从魔芋块茎中直接提取葡甘聚糖酶酶解。目前常采用的方法是微生物酶解葡甘聚糖，因为酶在微生物中普遍存在，具有极佳的催并且微生化活性，可显著提高反应速度1×106～1×1010倍[4]，物具有分布广、种类齐全、易于大量制取等特点[5]。目前国内外对于葡甘聚糖酶的研究仍处于起步阶段，葡甘聚糖酶产量低，酶活不高[6]，对葡甘聚糖酶产生菌筛收稿日期：2021-02-23分离、鉴定及酶学性质研究得到的产葡甘聚糖酶微生物选、海洋葡甘聚糖酶的研究在国内鲜现。大多来源于土壤[7-10]，本研究从海泥和海水样品中筛选出一株葡甘聚糖酶高产枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）Q1，以Q1为出发菌株，通过单因素实验优化Q1产酶条件，粗酶液经硫酸铵盐析、透析和超滤、SephadexG-100凝胶柱层析进行分离纯化，并进行酶学性质的研究。目的是增加葡甘聚糖酶产量，提高酶催化效率，降低生产成本，为葡甘聚糖酶的工业化应用奠定基础。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌种枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）Q1：筛选自大连周边基金项目：国家高技术研究发展计划‘863计划’项目（2007AA021306）作者简介：王强（1990-），女，硕士研究生，研究方向为微生物酶制剂研究。*通讯迟乃玉（1965-），男，教授，博士，研究方向为微生物酶制剂研究。研究报告中国酿造2021年第35卷第5期·总第291期87·海域的海泥、海水样品，现由辽宁省海洋微生物工程技术研究中心保藏。1.1.2培养基保藏培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl0.5%，琼pH7.0，121℃灭菌20min。脂2%，种子培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl0.5%，pH7.0，121℃灭菌20min。发酵培养基：蛋白胨0.1%，牛肉膏0.3%，NaCl0.5%，魔芋粉0.5%，pH7.0，121℃灭菌20min。1.1.3主要试剂蛋白Marker：加拿大Fermentas公司；魔芋粉：大连凯美化工工程配套；葡甘聚糖：合肥博美生物科技有限责任公司；其余试剂均为国产分析纯。1.2仪器与设备LDZX-40BI立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；LTI-700恒温培养箱：上海爱朗仪器；HZP-250全温振荡培养箱：上海精宏实验设备；HD-1360超DYY-6C电泳净工作台：北京东联哈尔仪器制造；仪：立德泰勀（上海）科学仪器；AL-204电子天平：梅特勒-托利多仪器；GelDocXR+凝胶成像系统：广州市龙煜生物科技。1.3方法1.3.1培养方法菌株活化：将保存于4℃条件下的斜面菌株接种到保28℃培养24h，以备后续实验使用。藏培养基中，种子液制备：将已经活化好的菌株接种到种子培养基中，28℃、150r/min振荡培养24h，作为一级种子液；接种到种子培养基中，将一级种子液以5%接种量，28℃、150r/min振荡培养24h，作为二级种子液。1.3.2甘露糖标准曲线的制作称取100mg无水甘露糖（105℃干燥至恒质量），用适量蒸馏水将其溶解，并定容至100mL。取25mL具塞试管10支，分别加入质量浓度1mg/mL甘露糖溶液0、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL，并加蒸馏水补足至1.0mL，加入3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylicacid，DNS）试剂[11]，混合均匀。100℃水浴显色5min，冷却至室温后，用蒸馏水定容至20mL，于波长540nm处测定其吸光度值。以甘露糖质量浓度（x）为横坐标，OD540nm值（y）为纵坐标绘制甘露糖标准曲线，线性回归方程为y=0.5615x，R2=0.9991。1.3.3葡甘聚糖酶酶活测定方法[12]0.9mL0.4%葡甘聚糖底物中，加入适当稀释的酶液0.1mL，30℃水浴10min，立即放入100℃水浴5min，终止反应，然后加入2.0mLDNS试剂，100℃显色5min，冷却至室温后，用蒸馏水定容至20mL，于波长540nm处测定吸葡甘光度值，根据甘露糖标准曲线及酶活公式计算酶活。聚糖酶活定义：在上述反应条件下，葡甘聚糖底物每分钟[13]释放1μmol甘露糖的酶量为1个酶活单位（U）。相对酶活为样品酶活与同组最高酶活之比。1.3.4发酵条件优化（1）不同碳源对酶活的影响分别选用0.5%的不同碳源（魔芋粉、可溶性淀粉、蔗糖、瓜尔豆胶、比目糖、木聚糖），将二级种子液以5%接种量，接种到发酵培养基中，28℃、150r/min振荡培养55h后测定酶活，每次做3组平行实验，下同。（2）魔芋粉添加量对酶活的影响以魔芋粉为碳源，改变培养基中魔芋粉添加量（0.25%、0.50%、0.75%、1.00%），将二级种子液以5%接种量，接种到28℃、150r/min振荡培养55h后测定酶活。发酵培养基中，（3）不同氮源对酶活的影响以复合氮（牛肉膏+蛋白胨、酵母膏+蛋白胨、氯化铵+蛋白胨、氯化铵+硝酸钠）作为氮源，将二级种子液以5%接28℃、150r/min振荡培养55h种量，接种到发酵培养基中，后测定酶活。（4）牛肉膏与蛋白胨配比对酶活的影响改变牛肉膏与蛋白胨配比（0.1%∶0.4%、0.1%∶0.3%、0.1%∶0.2%、0.2%∶0.4%、0.2%∶0.3%、0.3%∶0.3%、0.3%∶0.4%、0.1%∶0.1%），将二级种子液以5%接种量，接种到发酵培养基中，28℃、150r/min振荡培养55h后测定酶活。（5）氯化钠添加量对酶活的影响氯化钠添加量分别为（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），将二级种子液以5%接种量，接种到发酵培养基中，28℃、150r/min振荡培养55h后测定酶活。（6）初始pH对酶活的影响初始pH分别设置为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将二级种子液以5%接种量，接种到发酵培养基中，28℃、150r/min振荡培养55h后测定酶活。（7）培养温度对酶活的影响26℃、28℃、30℃、32℃、37℃的恒温摇床中，在24℃、将二级种子液以5%接种量，接种到发酵培养基中，150r/min振荡培养55h后测定酶活。（8）转速对酶活的影响在不同转速（130r/min、140r/min、150r/min、160r/min、170r/min）恒温摇床中，将二级种子液以5%接种量，接种到发酵培养基中，26℃振荡培养55h后测定酶活。（9）装液量对酶活的影响分别按不同装液量（50mL/250mL、75mL/250mL、100mL/250mL、125mL/250mL、150mL/250mL、175mL/250mL）装入发酵培养基，将二级种子液以5%接种量接种到发酵培养基中，26℃、160r/min振荡培养55h后测定酶活。·88·2021Vol.35No．5SerialNo．291ChinaBrewingResearchReport（10）接种量对酶活的影响分别设置不同接种量（3%、4%、5%、6%、7%）的发酵26℃、160r/min振荡培养55h后测定酶活。培养基，1.3.5酶的分离纯化（1）粗酶液制备将菌株Q1二级种子液以5%接种量接种到装液量为100mL/250mL的发酵培养基中，26℃、160r/min振荡培养55h，发酵液经4℃、6000r/min离心20min，上清液即为粗酶液。（2）硫酸铵沉淀参照硫酸铵盐析溶解度表，向粗酶液中加入硫酸铵固体，使硫酸铵饱和度分别为30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%，置于4℃冰箱中过10000r/min离心20min，沉淀分别用1mL磷酸缓冲液夜，（pH6.0）进行溶解。取每个饱和度的上清和沉淀分别测定酶活，并绘制盐析曲线。（3）透析和超滤将盐析得到的样品装入预先处理好的透析袋（截留分子质量14000u）中，4℃条件下透析，期间更换透析液，直至透析液中检测无SO42-为止；将完成透析的样品转移到10ku超滤管中，4℃、4000r/min离心10min，测定酶活。（4）SephadexG-100凝胶过滤层析将凝胶柱、蛋白检测仪、自动收集器和电脑正确连接，保持蛋白检测仪T值为100；待基线平衡以后，将超滤后的（Ф1.6cm×60cm）浓缩酶液2mL加入SephadexG-100凝胶柱中，使洗脱速度保持在0.3mL/min；调节自动收集器，使每个试管的收集时间为4min，根据显示器上的洗脱峰，收集相应试管洗脱液，测定酶活。1.3.6部分酶学性质（1）最适作用底物在酶最适作用条件下，分别以0.4%的淀粉、葡甘聚糖、瓜尔豆胶、魔芋粉作为底物，测定酶活，每次做3组平行实验。（2）相对分子质量确定（sodium通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）确定葡甘聚糖酶相对分子质量。电泳条件为：12%分离胶浓度，5%浓缩胶浓度，30mA恒流电泳2.5h，考马斯亮蓝R-250染色1h，乙醇醋酸脱色6h，期间需要更换脱色液，直至凝胶变透明，出现清晰的条带。2结果与分析2.1发酵条件优化2.1.1不同碳源对酶活的影响由图1可知，当用魔芋粉作为碳源时，葡甘聚糖酶相对酶活达到100%，瓜尔豆胶次之为69%，而以可溶性淀粉、蔗糖、木聚糖、比目糖作为碳源时，相对酶活几乎为零。因此，故该菌产生的葡甘聚糖酶为一种魔芋粉特异性诱导酶[15]，选择魔芋粉为最适碳源。图1碳源种类对酶活的影响Fig.1Effectofcarbonsourcetypesonenzymeactivity2.1.2魔芋粉添加量对酶活的影响魔芋粉主要成分是葡甘聚糖，葡甘聚糖具有凝胶性，浓度过高，会导致葡甘聚糖成为凝胶小球，不利于菌株Q1利用，影响酶的合成，而魔芋粉浓度过低则不利于酶的大由图2可知，当魔芋粉添加量为0.75%时，相对酶活量合成。达到100%；魔芋粉添加量为0.25%、0.50%、1.00%时，葡甘聚由于不同研究中使用的魔芋粉糖酶相对酶活均不足80%，黏度以及纯度各不相同，且不同菌株利用魔芋粉的能力有差别[16-17]。因此，选择魔芋粉最适添加量为0.75%。图2魔芋粉添加量对酶活的影响Fig.2Effectofkonjakuflouradditiononenzymeactivity2.1.3复合氮源对酶活的影响本研究中适合菌株Q1产酶的氮源组合为复合氮源，实验过程中牛肉膏与蛋白胨添加量分别为0.1%与0.3%，氯化铵与蛋酵母膏与蛋白胨的添加量分别为0.1%与0.3%，白胨的添加量分别为0.1%与0.3%，氯化铵与硝酸钠的添加以牛肉膏与蛋白胨为量分别为0.1%与0.3%。由图3可知，复合氮源时，葡甘聚糖酶相对酶活达到100%；酵母膏与蛋白胨为复合氮源时，相对酶活次之，为79%，氯化铵与蛋白胨作为复合氮源时，相对酶活最低，仅为67%。因此，选择牛肉膏与蛋白胨复合氮源为最适氮源。研究报告中国酿造2021年第35卷第5期·总第291期89·由图5可知，氯化钠添加量在0.1%～0.4%时，葡甘聚糖酶相对酶活呈上升趋势，氯化钠添加量为0.4%时，相对酶活氯化钠添加量＞0.4%时，相对酶活呈下降趋势。达到100%，说明浓度过高或过低都不利于菌株产酶，适量氯化钠对Q1产酶有促进作用。因此，氯化钠最适添加量为0.4%。2.1.6初始pH对酶活的影响菌株生长需要适合的pH，产物合成也需要适宜的pH[19]。由图6可知，初始pH值为7.0时，相对酶活达到100%；初始pH值为6.0时，Q1产酶相对酶活达到80%，pH5.0、pH8.0、图3复合氮源种类对酶活的影响pH9.0时，相对酶活不高，均在60%左右，说明该菌具有一定的耐酸性。因此，菌株发酵最适初始pH值为7.0。Fig.3Effectofcompoundnitrogensourcetypesonenzymeactivity2.1.4牛肉膏与蛋白胨配比对酶活的影响由图4可知，当牛肉膏与蛋白胨配比为0.2%∶0.4%时，葡甘聚糖酶相对酶活达到100%；当牛肉膏与蛋白胨配比0.1%∶0.3%、0.1%∶0.2%时，相对酶活均分别为0.1%∶0.4%、当牛肉膏与蛋白胨质量比分别为0.2%∶0.3%、不足60%；0.1%∶0.1%、0.3%∶0.4%、0.3%∶0.3%时，相对酶活也呈下降趋势，说明氮源浓度过低不利于酶的大量合成，氮源浓度过高对菌体生长有一定抑制作用，影响酶的合成[18]。因此，当最适合菌体生长。牛肉膏与蛋白胨的配比为0.2%∶0.4%时，图6初始pH对酶活的影响Fig.6EffectofinitialpHonenzymeactivity2.1.7培养温度对酶活的影响由图7可知，在26℃时，葡甘聚糖酶相对酶活为100%，此后，随着温度的升高，相对酶活越来越低，说明菌株Q1是低温菌，高温条件会影响其生长，进而影响其产酶。本实验优化的培养温度低于熊郃等[20-21]研究所得的培养温度，可能是因为菌株Q1是从海洋样品中筛选得来，海洋环境温度较低。因此，最适培养温度为26℃。图4activity牛肉膏与蛋白胨质量比对酶活的影响Fig.4Effectofbeefextractandpeptonemassratioonenzyme2.1.5氯化钠添加量对酶活的影响图7培养温度对酶活的影响Fig.7Effectofculturetemperatureonenzymeactivity2.1.8转速对酶活的影响转速主要调节发酵过程中的通氧量，转速过低，通气图5氯化钠添加量对酶活的影响量小，发酵液溶氧不够，不利于菌体生长繁殖及酶的合成；转速过快，会导致菌体自溶[22]。由图8可知，转速在130～Fig.5Effectofsodiumchlorideadditiononenzymeactivity·90·2021Vol.35No．5SerialNo．291ChinaBrewingResearchReport160r/min之间时，相对酶活逐渐增加；转速为160r/min时，相对酶活达到100%；转速＞160r/min时，相对酶活开始下最适转速为160r/min。降。因此，由图10可知，当接种量为3%～4%时，葡甘聚糖酶相对酶活较低，均不足60%；接种量为5%时，相对酶活达到100%，之后随着接种量的增加，相对酶活反而下降，由于通气量和营养物质等因素的限制，所以发酵液中的菌体数最适接种量为5%。量不宜过多。因此，2.2酶的分离纯化2.2.1硫酸铵盐析曲线从图11可知，当硫酸铵的饱和度达到45%的时候，沉淀中开始测得葡甘聚糖酶酶活，而上清液中的葡甘聚糖酶酶活开始下降，当硫酸铵的饱和度达到75%的时候，上清液中几乎没有葡甘聚糖酶的活性，而沉淀中的葡甘聚糖酶酶活达到最高，因此可以确定硫酸铵分段盐析沉淀葡甘聚图8转速对酶活的影响糖酶的范围为45%～75%。Fig.8Effectofrotatespeedonenzymeactivity2.1.9装液量对酶活的影响由图9可知，装液量为100mL/250mL时，葡甘聚糖酶相对酶活达到100%；装液量为50～75mL/250mL时，相对酶活为70%左右，说明此时溶氧量相对适宜，对菌体产酶有较好的促进作用。装液量为100～175mL/250mL时，酶活呈现下降趋势，说明此时溶氧量较少，影响菌株产酶。因此，最适装液量为100mL/250mL。图11硫酸铵盐析曲线Fig.11Curveofammoniumsulfatesalting-out2.2.2SephadexG-100凝胶过滤层析由图12可知，超滤后的酶液经过SephadexG-100凝胶过滤层析，出现5个蛋白吸收峰，但经过酶活测定发现，仅在16#～34#管的收集液中有葡甘聚糖酶活性。将收集的葡甘聚糖酶液保存于4℃冰箱中，进行后续酶学性质的研究。图9装液量对酶活的影响Fig.9Effectofliquidvolumeonenzymeactivity2.1.10接种量对酶活的影响图12SephadexG-100凝胶过滤层析Fig.12GelfiltrationchromatogramofSephadexG-1002.2.3酶部分性质图10接种量对酶活的影响（1）酶最适作用底物魔芋粉和瓜尔豆胶的主要成分都是葡甘聚糖，但葡甘Fig.10Effectofinoculumonenzymeactivity研究报告中国酿造2021年第35卷第5期·总第291期91·聚糖含量不同，导致葡甘聚糖酶对其水解程度不同。由图13可知，以葡甘聚糖作用底物时，葡甘聚糖酶相对酶活达到100%，魔芋粉次之为83%，可溶性淀粉作为底物时，相对酶活最低，仅为8%，故葡甘聚糖酶最适作用底物为葡甘聚糖。糖酶酶活为241.61U/mL。参考文献：[1]RATCLIFFEI,WILLIAMSPA,VIEBKEC,etal.Physicochemicalcharacterizationofkonjacglucomannan[J].Biomacromolecules,2005,6(4):1977-1986.[2]钟燕，索化夷.魔芋葡甘聚糖的功能及在食品领域的应用[J].中国彪.酵母细胞壁多糖对免疫功能的作用机制[J].酿造，2021，33（8）：6-9.[3]李春松，戴晋军，李饲料研究，2021（2）：22-23.[4]STEWARTKK,EBELRE.Chemicalmeasurementsinbiologicalsys-tems[M].Beijing:Wiley-Interscience,2000:32-33.广西大[5]董桂清.产葡甘聚糖酶菌株的筛选及酶的分离纯化[D].南宁：学硕士论文，2007.杨三东，周大寨，等.发酵生产魔芋葡甘聚糖酶[J].中国生物[6]周海燕，图13酶最适作用底物工程杂志，2005，25（3）：65-68.[7]曲丽娜.β-甘露聚糖酶的发酵优化和性质研究[D].济南：齐鲁工业大学硕士论文，2021.吴风，刘峰，等.乳白耙菌β-葡甘聚糖酶产酶条件优化[J].[8]邬建国，食品工业科技，2021，37（7）：88-90.[9]王静.β-甘露聚糖酶的制备与分离纯化的研究[D].南京：南京林业磊，高成华，等.一株产甘露聚糖酶菌株的分离鉴定及大学硕士论文，2021.翟[10]廖婷婷，酶的纯化与性质[J].微生物学报，2021，51（11）：1520-1526.李志波，徐君飞.产酸性甘露聚糖酶菌株的筛选、鉴定及酶[11]张居作，2021，33（11）：63-66.活性研究[J].中国酿造，[12]冯娜，赵君，赵敏.β-甘露聚糖酶产生菌DY-14的发酵条件及分离纯化[J].黑龙江医药，2021（3）：397-401.[13]李江华，房俊，邬显章.黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的摇瓶发酵条件[J].江苏食品与发酵，2002，12（4）：16-18.湖南农业大学硕士论[14]陈思洋.发酵法生产魔芋葡甘聚糖酶[D].长沙：文，2021.[15]许剑，孙学哲，陈强，等.一株产常温葡甘聚糖酶的芽孢杆菌的分离、鉴定及产酶发酵条件的研究[J].基因组学与应用生物学，2021，31（5）：422-429.[16]周海燕.酶法生产魔芋葡甘低聚糖研究[D].长沙：湖南农业大学硕士论文，2004.[17]陈一平，龙剑儿，廖连华，等.芽孢杆菌M50产生β-甘露聚糖酶的条件研究[J].微生物学报，2000，40（1）：62-68.[18]孙子羽，迟乃玉，李兵，等.响应面法优化产低温生淀粉糖化酶发秀.黑曲霉HS-5高产β-葡聚糖酶发酵条件优酵培养基[J].中国酿造，2021，29（7）：110-114.[19]吴[20]熊鹏，王知龙，吴郃，干2021，34（3）：54-57.化[J].中国酿造，信.β-甘露聚糖酶产生菌R10发酵条件研究[J].湖北工学院学报，2004，19（1）：17-19.[21]成莉凤，戴小阳，冯湘沅，等.BacillussubtilisBE-91生长及其胞外表达β-甘露聚糖酶的发酵条件优化[J].微生物学通报，2021，42（12）：2300-2307.[22]孙倩，陈复生，丁长河，等.地衣芽孢杆菌产碱性蛋白酶发酵条件优化[J].食品工业科技，2021，33（13）：174-177.Fig.13Theoptimumsubstrateofglucomannanase（2）相对分子质量盐析酶液和纯化后的葡甘聚糖酶取样进行将粗酶液、SDS电泳。结果如图14所示，根据分子量和相对迁移率的关系，计算出葡甘聚糖酶的分子质量为41.3ku。注：M为Maker；1为粗酶液；2为盐析；3为SephadexG-100凝胶过滤层析图14SDS电泳图Fig.14ElectrophoretogramofSDS结论本文通过单因素实验，优化了海洋来源的枯草芽孢杆菌Q1的发酵条件，目的是获得更高活性的葡甘聚糖酶，并对葡甘聚糖酶进行分离纯化，研究其部分酶学性质。结果表明，优化发酵条件为：魔芋粉添加量0.75%、牛肉膏与蛋白胨添加量分别为0.2%与0.4%，氯化钠添加量0.4%、培养温度26℃、转速160r/min、接种量5%、初始pH7.0、装液量100mL/250mL。酶最适作用底物为葡甘聚糖；酶的相对分子质量为41.3ku。发酵条件经过优化后，测得Q1产葡甘聚究3栾国颜 阎丽萍 高维平(化学工程系)究3栾国颜 阎丽萍 高维平(化学工程系)摘要介绍了一种从松节油中提蒎烯蒎烯的新型分离工艺并对工艺条件进行了优化研究确定了最佳工艺条件1关键词松节油;分离;蒎烯;共沸蒸馏中国分类号 TQ02813引言0节油是世界上产量最大的一种天然精油,年产量约30万吨,我国年产松节油约6吨,居世界第二位1松节油的主要成分蒎烯蒎烯,除此之外,还含有少量的莰烯苎烯双戊烯松油烯等萜烯和倍半萜1,2蒎烯蒎烯是香料工业的重要原料,纯度很高蒎烯价格不亚于黄金31国松节油主要用于生产油漆溶剂樟脑冰片选矿油等,从70年代起部分作香料的原料加以利用,但处理量小,尚有1万吨的积压1因此,充分利用我国丰富的松节油资源,开发更多的香料品种,是势在必行的1松节油中分离提蒎烯蒎烯,国外使用的工业化方法是采用传统的精馏法以设备技术先进的英国BA公司和美国的iden公司为例,均是采用一百多层理论板的高效精馏塔进行分离的,这样高的塔必须配备电脑和高级自动化仪表控制,才能保证精馏过程的正常运行1这种传统的精馏方法,存在设备复杂操作困难投资和管理费用大能耗大单位时间内的产量不高等缺点,不适合一些中小企业采用1国内目前采用的分离方法是理论板为55～67层的重复精馏3,4,该法存料利用率低,效果不理想1本研究开发一种新型分离工艺,利用理论板数仅为24～30(精馏柱为08m长三角料柱)层的间歇精馏塔,分两步的简便分离过程,即可提取纯度较高的蒎烯蒎烯实验还对工艺条件进行了优化研究1该分离工艺不仅目的产品质量好,分离要求的条件也极易满足,很适合一些小厂生产1收稿日期:19971007第一作者:男,1964年生研究生讲师3参加实验工作的还有93级毕业生周广喜恭孝梅金英虎—11 —实验部分11.1 实验原理及工艺过程统的蒸馏是以溶液中各组分的挥发度不同作为分离的依据,之所以分离松节油困难实验部分11.1 实验原理及工艺过程统的蒸馏是以溶液中各组分的挥发度不同作为分离的依据,之所以分离松节油困难,是因蒎烯蒎烯属同分异构体,沸点差小,挥发度接近,利用普通精馏法很难以较小的理论板数使之分开1本工艺采用特殊的精馏方式,即添加第三组分,使之与原组分形成恒沸物的共沸精馏法,人为地进非理想化处理,使该体系的汽液平衡时的汽液热力学曲面间距扩大,达到有利分离的目的1实验用松节油为某厂生产中的副产物,含杂质成分较多酸性较强1本实验根据原料特点采用双塔工艺11.1.1 初馏先对原料松节油进行初馏1主要除去蒎烯更重的组分,从塔顶获蒎烯和蒎烯的混合物1为了提高拔出率及减少高温蒸馏造成的副产物增加,初馏过程采用了减压操作11.1.2 共沸精馏馏获得蒎烯蒎烯的混合物作为共沸塔的原料,按一定比例添加第三组分NL1同样,采用减压蒸馏1从塔顶获蒎烯的恒沸物;塔底获蒎烯的恒沸物1然后经分层水洗等处理即可得到产蒎烯蒎烯11.2 实验仪器和材料11D1型接触调压器21东风牌DM型连续可调控温电热套31C501型超级恒温器41J型阿贝折光仪51SHC循环水多用真空泵61夹套式填料精馏塔(自制)7101型干燥箱817气相色谱仪1.3 实验装置实验装置见图111.4 实验步骤1.4.1 松节油初馏91台式自动平衡记录仪101DMB色谱数据处理机111其它仪器温度计:200℃,300℃四口烧瓶:1000L量筒:100L分液漏斗:250L烧杯:800L,600L,400L,200L(1)(2)(3)(4)(5)按图1的装置图组装仪器1加料1用烧杯量取约600L松节油加入四口烧瓶,放几粒沸石,旋紧塞子1加热1打开电源开关,调节电热套及调压器电压,控制釜温及加热套温度1抽真空1打开循环水式多用真空泵,通过放空阀调节真空度1塔顶出现蒸汽时,通冷凝水,并根据蒸汽量控制水流大小1—12 —(6)全回流一段时间,待稳定后,通过回流量调节,控制塔顶温度85～130℃,从塔顶采蒎烯蒎烯的混合物,同时取样用色谱或折光仪分析其纯度17)当塔顶蒸汽量很少时,可以停止实验1(8)将电热套及调压器电压调至零伏,关掉电源(6)全回流一段时间,待稳定后,通过回流量调节,控制塔顶温度85～130℃,从塔顶采蒎烯蒎烯的混合物,同时取样用色谱或折光仪分析其纯度17)当塔顶蒸汽量很少时,可以停止实验1(8)将电热套及调压器电压调至零伏,关掉电源,停真空泵和冷凝水1(9)抽取釜液,取样分析11.4.2共沸精馏(1)加料1用烧杯量取约400L初馏液,按油剂比=5～12:1的比例加入NL,投入几粒沸石,旋紧塞子1(2)热1关电热套及压度11.套;2.瓶;3.柱;4.管;5.器;6.器;7.计;8.器图1实验装置图(3)抽真空1开真空泵检查是否漏气,通过放空阀调节真空度1(4)塔顶出现蒸汽时,通冷凝水,并根据蒸汽量控制水流大小1(5)全回流一段时间,待塔稳定后,通过回流量调节,控制塔顶温度100～114始采出;馏出液用分液漏斗静止分层,并取样分析;回收NL备循环使用1(6)当塔顶蒸汽很少时,可以停止实验1(7)将电热套及调压器电压调至零伏,关掉电源,停真空泵和冷凝水1(8)抽取釜液,用分液漏斗静止分层并取样分析11.4.3 工艺条件的优化针对不同的真空度油剂比进行了最佳工艺条件筛选实验1℃,开实验结果与讨论22.1 实验结果实验结果见表1～表6,图2～图41表1实验松节油中各组分含量(重量)表3初馏馏出液中组分含量(重量)蒎烯蒎烯号3蒎烯蒎烯序号重组分序142.8537.4619.69173.02726.9723号1厂表2松节油的折光率测定样品标号折光率1折光率2折光率3平均值相对误差1相对误差2相对误差311.49941.49951.49921.499400.0067-0.0133—13 —图2原料液气相色谱图图3初馏馏出液气相色谱图表4不同操作条件共沸精馏气相色谱分析结果真空度(Ma)原料配比(油剂比)馏出液蒎烯馏出液蒎烯釜液蒎烯釜液蒎烯序号123456780.0850.0910.0800.0660.0980.0510.0800.0808:18:110:19:18:图2原料液气相色谱图图3初馏馏出液气相色谱图表4不同操作条件共沸精馏气相色谱分析结果真空度(Ma)原料配比(油剂比)馏出液蒎烯馏出液蒎烯釜液蒎烯釜液蒎烯序号123456780.0850.0910.0800.0660.0980.0510.0800.0808:18:110:19:18:18:16:110:188.08