第4章 蛋白质的共价结构

第4章蛋白质的共价结构蛋白质（Protein）1838年，J.J.Berzelius提出，由proteios衍生而来——第一重要，首要的物质蛋白质存在于所有生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，参与了几乎所有的生命活动过程。一、蛋白质通论（一）、蛋白质的化学组成和分类１、元素组成２、蛋白质的含氮量蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。大多数蛋白质含氮量接近于16%

蛋白质含量=每克样品中含氮的克数

6.25凯氏定氮法３、蛋白质的分类（1）、依据外形分类球状蛋白质：globularprotein

纤维状蛋白质：fibrousprotein

膜蛋白质：membraneprotein

（2）、依据蛋白质的组成分类简单蛋白

simpleprotein

单纯蛋白，仅由氨基酸组成结合蛋白

conjugatedprotein由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成简

单

蛋

白清蛋白和球蛋白albuminandglobulin广泛存在于动物组织谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱精蛋白和组蛋白碱性蛋白存在于细胞核硬蛋白

结

合

蛋

白色蛋白：简单蛋白+色素物质糖蛋白：简单蛋白+糖类物质脂蛋白：简单蛋白+脂类结合核蛋白：简单蛋白+核酸（二）、蛋白质的大小与分子量蛋白质是分子量很大的生物分子对任一种给定的蛋白质，其所有分子在AA组成和顺序以及肽链的长度方面都应是相同的，即所谓均一的蛋白质。蛋白质与多肽无严格的界线

——通常将6000Dr以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大蛋白质——月示——胨——多肽——肽——AA1*1045*1032*1031000200100-500（三）蛋白质构象和结构的组织层次蛋白质的结构层次一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构高级结构空间构象示例（四）、蛋白质功能的多样性1.催化功能-酶2.调节功能-激素、基因调控因子3.转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白4.贮存功能-乳、蛋、谷蛋白5.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白6.结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架7.支架作用-接头蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.异常功能二、肽（peptide）AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。由两个AA组成的肽称为二肽。由多个AA组成的肽则称为多肽。组成多肽的AA单元称为氨基酸残基。多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序含游离

-氨基的一端：氨基端或N-端含游离

-羧基的一端：羧基端或C-端AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln（一）、肽和肽键的结构①肽键中C-N键有部分双键性质——不能自由旋转②组成肽键原子处于同一平面（肽平面）③键长及键角一定④大多数情况以反式结构存在共价主链

（二）、肽的物理化学性质肽末端α-羧基pKa值比游离AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游离AA中的小。等电点（两性）。酸碱性质取决于：

—α-羧基、α-氨基、侧链基团的解离

具有双缩脲反应——Pr特有的反应。（三）、天然存在的重要多肽三、蛋白质一级结构的测定什么是Pr的一级结构？蛋白质中氨基酸的排列顺序。1.样品必需纯（>97%以上）2.知道蛋白质的分子量3.知道蛋白质由几个亚基组成4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量计算每种AA的个数5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量前提（一）、蛋白质测序策略(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略(2)

多肽链的拆分蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略(3)

断开二硫键在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的

-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略蛋白质一级结构的测定(4)测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比

（一）、蛋白质测序策略(5)分析多肽链的N-末端和C-末端(6)多肽链断裂成多个肽段采用两/多种不同的断裂方法将多肽断裂成两套或多套肽段，并将其分离。蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略(7)测定每个肽段的氨基酸顺序蛋白质一级结构的测定(8)确定肽段在多肽链中的次序利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。（一）、蛋白质测序策略(9)确定原多肽链中二硫键的位置。蛋白质一级结构的测定两类多肽链末端氨基酸残基：N-端氨基酸C-端氨基酸在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸残基测定Sanger法1、末端分析

二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+

H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定N碱性条件二硝基苯衍生物黄色二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高

丹磺酰氯（DNS）法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析1N(DNS-aa)

苯异硫氰酸酯（PITC)法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析1N—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF苯异硫氰酸酯PITC肽链外切酶:从多肽链N-端逐个向里水解根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量，按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线蛋白质N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶—水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。④氨肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析1N肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质①

肼解法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析2C（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析2C

C末端AAα氨基醇②

还原法硼氢化锂肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解根据不同反应时间释放出的AA种类和数量蛋白质C-末端残基顺序。四种羧肽酶：A,B,C和Y；A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母)∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基∽B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键

③羧肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析2C（三）、二硫键的断裂盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价力。应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。1、酸水解（四）、氨基酸组成的分析2、碱水解1、酶解法:内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽链的选择性降解（五）、多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯