第04章 临床酶学检验技术

第四章临床酶学检验技术江苏大学基础医学与医学技术学院姜旭淦全国高等医药院校医学检验专业规划教材

临床生物化学检验

（第二版）生物体内的酶（enzyme）是对其特异底物起高效催化作用的蛋白质和核糖核酸，前者是是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。酶的概念2目

录酶学基本知识1血清酶变化的生理病理机制2酶含量的表示方法3酶催化活性浓度测定的理论基础4酶活性测定的影响因素与最适条件的确定5同工酶检测技术6目前常用诊断酶的酶活性测定73酶的结构和分类一酶的特性和应用二酶促反应动力学三第一节酶学基本知识4酶的结构和分类一辅因子（一）酶的组成单纯酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等结合酶酶蛋白（apoenzyme）（cofacter)辅酶（coenzyme)辅基(prostheticgroup)全酶(holoenzyme）=酶蛋白+辅因子全酶5（二）酶的分子形式单体酶：只有单一的三级结构蛋白质构成寡聚酶：由两个以上具有三级结构的亚基聚合而成多酶复合体：由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体(oligomericenzyme)(multienzymesystem)（monomericenzyme)6乳酸脱氢酶同工酶——寡聚酶7（三）酶的结构“非”必需基团必需基团结合基团：催化基团：活性中心：酶分子中直接和底物结合并起催化反应的空间局限（部位）(Bindingsite)(Catalyticsite)决定酶的专一性决定酶所催化反应的性质（活性中心）8

酶的特性和应用二酶的特性（一）高效催化性（二）高度特异性（三）可调节性（四）不稳定性9（一）高效催化性10一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种特性称为酶的特异性或专一性。酶的特性——高度特异性(specificity)（二）绝对特异性(absolutespecificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物

。相对特异性(relativespecificity)：作用于一类化合物或一种化学键。立体结构特异性(stereo

specificity)：作用于立体异构体中的一种。11对酶生成与降解量的调节酶催化效率的调节通过改变底物浓度的调节多酶体系、关键酶（限速酶）

酶的特性——可调节性（三）12酶促反应在温和条件下进行加热、过酸、过碱、重金属都可以使酶活性降低（失活）

酶的特性——不稳定性（四）13●

改变

pH●

急速

加热

●

加入变性剂●

加入金属鳌合剂●

加入酶抑制剂抑制剂●

大量稀释TCABoilingSDSEDTAPMSF-----化学物理化学化学化学物理酶不稳定性——终止酶促反应的方法PMSF：Phenylmethanesulfonylfluoride，苯甲基磺酰氟，用于抑制蛋白酶

14

添加物

作用

一般使用浓度Tween-20,TritonX-100NaN3(sodiumazide)EDTAb-MercaptoethanolDithiothreitol(DTTorDTE)BSA(bovineserumalbumin)Glycerol,glucosePMSF,TPCK,TLCK,benzamidine

除去重金属

抑菌剂防冻剂蛋白酶抑制剂

表面活性剂

抗氧化剂

抗氧化剂

稳定剂

0.1～1mmol/L0.01%50%微量0.5～0.05%1～

10mmol/L1～

5mmol/L0.1～

10mg/mL

酶不稳定性——缓冲液常用的添加物15添加物TLCK：对甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮TPCK：L-苯甲磺酰苯丙氨酰氯甲酮Benzamidine

苄眯β-Mercaptoethanol：β-巯基乙醇Dithiothreitol(DTT)：二硫苏糖醇

16酶在医学检验中的应用——举例主要特性应用技术举例化学本质是蛋白质高效催化性、高度特异性、反应条件温和催化剂反应前后没有变化形成中间络合物酶催化活性与酶量成正比高效催化性酶蛋白定量酶法测定代谢物固相酶技术抗体酶诊断酶学ELISACK-MB质量、前列腺特异抗原己糖激酶法测定血糖葡萄糖氧化酶膜电极测血糖抗病毒疫苗ALT、CKPOD、ALP

17酶促反应动力学（KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction

）三18表示为：

底物：Subestrate：S产物：Product：P酶：Enzyme：E酶促反应----中间产物学说19（一）米氏方程1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程（Michaelis-Mentenequation）。20（二）动力学参数1.初速度(initialvelocity)：在反应最初阶段底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度，用v0来表示2.最大反应速度(maximumvelocity)：当酶的结合位点与底物结合饱和时的反应速度，通常用V或Vmax来表示3.米氏常数（Michaelisconstant，Km）：酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位同底物浓度21（三）Km在临床上的应用（1）反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。（2）计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的百分率。当底物浓度为10～20Km时，反应速度可达到最大反应速度的90﹪～95﹪。（3）根据Km值选择酶的最适底物。（4）确定工具酶用量。（5）确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依据。22（四）影响酶促反应的因素

1.底物浓度对酶促反应的影响

（1）当[S]<<Km时，反应速率与底物浓度[S]成正比，呈一级反应。

V＝Vmax[S]/Km＝K[S]——用工具酶来测定各种代谢物浓度的方法学基础。（2）当[S]>>Km时，反应速率与底物浓度[S]无关，V＝Vmax＝K[E]，称为零级反应，反应速率与酶浓度[E]成正比。酶学测定时一般底物浓度可选择为Km的10～20倍。

23底物浓度与Km比值相当的最大反应百分比[S]/KmV/Ｖmax×100100.099.010.091.01.050.00.19.00.010.99242.温度的控制最适温度：不同酶类、反应条件（1）Q10值：温度增加10℃，化学速度的变化率。酶的Q10值：1.5~2.5。（2）使用37℃，是从实际工作方便来考虑。因为温度升高，反应速度快，灵敏度高。同时延滞时间和测定时间都可能缩短。从而有利于提高工作效率。但在37℃时，不可避免地一些酶可能失活。（3）曾推荐25℃为酶测定温度，其优点为接近室温，反应体系温度很容易平衡到此温度。但温度低，反应太慢。（4）IFCC推荐的30℃，兼顾了上述二温度的优点，即保证了一定的反应速度，又无酶失活之扰。25常见酶温度转化系数

25℃30℃37℃CK0.641.001.56LD0.751.001.44ALT0.761.001.38AST0.731.001.52ALP0.781.001.30GGT0.731.001.31CHE0.811.001.26HBDH0.851.001.10263.辅因子、活化剂的种类和浓度辅因子（cofactors）:一种酶的活性所需要的一种非蛋白质成分。（1）辅酶（Coenzyme）：NAD、NADP、ATP等，与酶蛋白结合很松弛，用透析和其它方法很易将它们与酶分开。在作用方式上和底物类似，在方法学上，将它们按底物处理。（2）辅基：是酶蛋白不可分割部分，转氨酶需要磷酸吡哆醛为其辅基。显著特点之一是与酶结合需要一定时间，因此在酶测定时，先加入足量辅基，作用一定时间如10分钟后，再加入底物开始酶反应。（3）离子很多酶需要特定离子帮助才能使其反应达到最大速度。最常见的是二价金属离子如Mg2+、Zn2+等。要选择合适的浓度。（4）其它如巯基化合物可稳定酶的双硫键。274.抑制剂最常见的抑制剂：产物的抑制、底物的抑制，重金属及体液中的药物等造成的抑制。抑制类型：可逆抑制、不可逆抑制。去除抑制采取的措施：选用高纯度的原料、高纯净水、器材干净，在反应液中加入金属螯合剂，甚至可以引入一个副反应来去除产物的抑制作用。28根据对酶活性的影响不同可将缓冲溶液分为活性、抑制、惰性三类。各种体液样品也是缓冲液，应严格掌握测定样品与底物的用量比例，样品在总体积中所占的比例应不超过10%。5.缓冲液的种类、离子强度和pH29四、酶促反应进程1.延滞期酶促反应开始至达到最大反应速度所需要的时间。2.线性期酶促反应速度保持恒定的时期，不受底物浓度的影响。3.非线性期随着反应时间的延长，底物消耗越来越明显，酶促反应速度明显下降，偏离线性而进入非线性期。30酶促反应时间进程曲线浓度(C)延滞时间测定时间31酶偶联反应Ex：待测酶Ea：辅助酶Ei：指示酶

32酶偶联反应

1.酶偶联反应有一个明显的延滞期。反应一开始只存在底物A，不存在指示酶的反应，随着产物B的出现和增加，指示酶反应随之加快，Ex和Ei反应速度相等，也就是达到稳态。从酶反应开始至稳态期间，称为延滞期。2.在酶偶联法，无法直接求出△A/△t，通过测定指示酶反应△C（D）/△t间接求出。要使酶偶联法测得的酶活性浓度准确可靠，则Vind＝Vx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测定酶的最大反应速度。3.用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反应，动力学上为零级反应。指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。33血清酶的来源与去路一血清酶变化的生理机制二血清酶变化的病理机制三第二节

血清酶变化的生理病理机制34一、血清酶的来源

（一）血浆特异酶：为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入血，在一定条件下被激活，从而引起相应的生理或病理变化。出凝血有关的酶或酶原、胆碱酯酶、铜氧化酶及脂蛋白脂肪酶等。（二）非血浆特异酶：①外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌进入血浆的酶，包括胰淀粉酶、胰脂肪酶、前列腺酸性磷酸酶等。血液中的含量与相应分泌腺的功能及疾病有关。②细胞内酶：存在于细胞内进行物质代谢的酶，随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。当其大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受损，最常用于临床诊断。35二、血清酶的去路

（一）

血清酶的半寿期(T1/2)1.定义：酶失活至原来一半时所需时间。

2.半寿期代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶，在血清中持续时间长。（二）血清酶的失活和排泄

1.酶的清除主要是在血管内失活或分解。

2.肾小球滤过从尿液中排除——淀粉酶等。

3.网状内皮系统清除36三、血清酶的生理变异

（一）性别少数酶如CK、ALP、ACP及GGT等有性别差异，与血清酶的来源组织有关。（二）年龄血清酶的活性随年龄而变化，ALP和GGT到老年时可有轻度升高。年龄差异也见于同工酶。（三）进食过量饮酒可使血清GGT明显升高。（四）运动多种血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及骨骼肌所含的酶量有关。（五）妊娠胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、LD、LAP和ALT（少数）等，引起血清中这些酶活性升高。（六）其他一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变化及家庭因素有关。37四、血清酶变化的病理机制1.酶合成异常（1）合成减少（2）合成增多2.细胞内酶释放增加大多数血清酶增高的主要原因（1）细胞内外酶浓度差异（2）酶在细胞内定位和存在形式（3）酶蛋白分子量的大小3.酶在细胞外间隙的分布和运送细胞中的酶有三种途径进入血液。4.酶的清除异常当肾功能减退时，血中AMY活性升高，说明酶排泄障碍而导致在血液中滞留。另外胆道梗阻时，梗阻区ALP合成加强，同时ALP排泄受阻而逆流入血，造成血液中ALP升高。38酶活性浓度表示法一酶蛋白质量浓度表示法二第三节

酶含量的表示方法39一、酶活性浓度的单位

（一）酶活性单位1．惯用单位酶活性测定方法的建立者所规定的单位。由于单位定义不同，参考值差别很大，难以进行比较。2．国际单位（internationalunit，IU）在特定的条件下，每分钟转化1

mol底物的酶量为一个国际单位。40（二）酶活性浓度单位体积样品中的酶活性单位，习惯用U/L来表示体液中酶活性即酶活性浓度（三）正常上限升高倍数（upperlimitsofnormal,ULN)：用测得的酶活性结果除以参考范围上限

41以mg/Ｌ或µg/Ｌ来表示优点：1．灵敏度高灵敏度达到ng/Ｌ至μg/Ｌ的水平。2．特异性高测定的影响因素较少，几乎不受体液中激活剂、抑制剂的影响，不受药物的干扰。3．可测定一些酶活性很难测定的酶。如不表达酶活性的酶原或脱辅基的酶蛋白或失活的酶蛋白。4．与酶活性测定一起，计算免疫比活性，有可能为临床应用提供新的资料和信息。5．在同工酶测定中的应用与电泳法和层析法相比，免疫学法测定简单快速灵敏度高，标本量少，重复性好。与化学抑制法相比特异性好。酶蛋白质量浓度表示法二

42定时法（Fixedtimeassay）

一连续监测法（Continuousmonitoringassay）二第四节

酶催化活性浓度测定的理论基础43（一）概念

将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，经过一定时间后，用终止液终止反应，通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度（－d[S]/min）或产物生成速度（d[P]/min），将速度换算为µmol/min便是以国际单位表示的酶活性。定时法一

44定时法无机P酚氨萘胺NAD(P)H酮酸淀粉ALT、AST、LDALP、ACP、5’NTALP、ACPADA、脲酶CK、GGTLD、GLD、G6PDAMS（二）定时法的方法设计显色物项目45（三）定时法（固定时间法）评价定时法：测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量，计算酶促反应平均速度。优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止，故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较大误差。46（一）概念

将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（2s∼60s）连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率，求出酶活性浓度。

连续监测法二

47（二）计算48（三）连续监测法中K值的检验

1.摩尔吸光系数（ε）对一定物质而言常是一个定值，但在一些外界条件影响下也会有所变化。（1）对硝基酚：当pH＞10时，405nm处其ε为18500；pH7.0，ε下降为9400，颜色下降几乎一半。（2）NAD(P)H：当波长大于334nm时，随温度升高，同一波长的ε值会轻度下降。2.ε值在近似单色光的光源条件下才能成立。自动分析仪使用干涉滤片，波峰值可能出现差异，半波宽可能为10nm乃至更大。由于杂散光的存在，会明显改变ε值。3.注加系统的误差49（四）连续监测法中常数K的意义和设置1.在测酶时，常数K值过高虽然测定的线性范围较宽，但重复性差；反之，虽然精密度好，但线性窄。2.设置与仪器测定的嗓音（noise）密切相关，自动分析仪吸光度读数嗓音一般都需控制在0.001，也就是仪器须保证对同一溶液反复进行测定时，吸光度误差最好控制0.001上下，虽然此值不大，但已可能使测定结果产生1/1000K值的误差。如K值为6000，则每分钟测定吸光度如有0.001微小变化，结果将是出现上下6U/L的误差。503.K值设置：（1）测定酶的判断值或参考值上限，保证测定的可靠，所以转氨酶的常数K一般在3000左右，不少人宁愿在1500左右，（2）应考虑到测定时间，测定时间短到0.5分，此时0.001嗓音对每分钟△A误差将是0.002，反之，测定时间延长到2分钟，误差也小一半。即测定时间长，则K值可以设置大一些，如测定时间只有0.5分钟，K值一般不超过4000。4.改变K值最方便的途径就是改变标本稀释度，稀释倍数愈大，K值愈大。51连续监测法色素原底物NAD(P)H系统过氧化物酶系统其他ALP、ALP、GGT、GPDA、AMS、AFULD、G6PD、HBDH、AD、SD、GLD、ALT、AST、CK、ADALPS、ADA、5’-NTCHE、ACP（五）连续监测法的方法设计52（六）连续监测法评价又称速率法或动力学法，指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间的变化量，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。优点：无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，就能将反应物变化的多点测定结果连接成线，观察到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活性，结果准确可靠。要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自动生化分析仪都能达到这些要求。53定时法连续监测法测总变化量，平均速度测速率终止酶促反应酶促反应一直进行多用化学方法检测多用酶偶联反应定时法与连续监测法的区别含延滞期或非线性期只计算线性期速度54第五节酶活性测定的影响因素

与最适条件的确定一、生理因素的影响二、标本采集与保存的影响三、方法因素的影响四、测定条件的影响五、其他因素对测定结果影响55一、

生理因素的影响肌肉组织中含量丰富的酶，如肌酸激酶、丙氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、醛缩酶等在不同性别、运动前后会有明显的差别。骨骼中含量丰富的酶类，如碱性磷酸酶则与年龄有关，在生长期破骨细胞和成骨细胞代谢更新非常活跃，因此较成年人高。妊娠时，由于胎盘中含有丰富的碱性磷酸酶，也较正常人高。有些酶还受饮食、药物的影响，如谷氨酰氨基转肽酶易被酒精和巴比妥类药物的诱导，有酗酒史者较正常人高。56二、标本采集与保存的影响

标本溶血：红细胞含量丰富的酶类，如LD、ALT等酶活性将会大幅度地升高。红细胞中的其他物质有时对酶活性测定也造成干扰，如腺苷酸激酶（AK）对肌酸激酶的干扰。很多酶类需要金属离子作为辅助因子，若抗凝剂使用不当，将会受到严重影响。酶蛋白一般具有热不稳定性，因此，酶尽量在低温保存，但忌反复冻溶，这在酶类质控液和校正液保存时尤其应引起重视。乳酸脱氢酶同工酶4和5具有“冷变性”的特点酸性磷酸酶最好保存于酸性环境中巯基酶的保存最好加入巯基保护剂57三、方法因素的影响

（一）

正向反应与逆向反应选择正向反应还是逆向反应，并不是随心所欲。一般根据测定底物或产物的难易程度来决定。原则上选择对底物亲和力大，酶转换率高的方向。（二）检测底物或检测产物选择测定底物或产物的方法主要取决于哪个更方便。原则上应选择测定产物的生成量而不是底物的消耗量。58（三）底物启动模式与样品启动模式

底物启动模式：样品先与部分试剂（缺乏某个底物）预孵育一定时间，然后加入这个底物，样品中的待测酶酶促反应才开始启动。优点：在待测酶酶促反应开始之前，可以除去某些干扰物，包括内源性干扰物和外源性干扰物。需要双试剂剂型，IFCC推荐法多采用底物启动模式。样品启动模式：反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品，依靠样品中的待测酶来启动酶促反应，在延滞期去除部分干扰物，可采用单一试剂剂型。59四、最适条件的确定

最适条件:能满足酶促反应速度达到最大反应速度所需的条件。（1）合适的底物和最适底物浓度（2）理想的缓冲液种类和最适离子强度（3）反应液的最适pH（4）

最适反应温度（5）

合适的辅因子、激活剂浓度（6）

若是酶偶联反应，还需要确定的指示酶和辅助酶的用量（7）

合理的测定时间，包括延滞期尽量短暂，有足够的线性期（8）

合适的样品与反应液比例（9）

足够的检测范围（10）尽量去除各种抑制剂60同工酶及亚型的概念一同工酶的分析方法二第六节同工酶检测技术61同工酶（isoezyme）：同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的一组酶。原级同工酶：酶蛋白结构不同的同工酶。

次级同工酶或酶多种形式：经加工或修饰后的同工酶。某些同工酶从组织进入体液后在蛋白酶作用下降解成不同的亚型（isoform）

一、同工酶及亚型的概念62二、同工酶的分析方法

方法同工酶（或亚型）的性质差异同工酶、亚型1.电泳法电荷不同所有同工酶、亚型2.色谱法离子交换色谱电荷不同CK，LD

3.免疫分析法免疫抑制法特异性抗体反应性不同CK、LD、ACP免疫化学测定法特异性抗体反应性不同CK、LD、ACP、ALP、AMY4.动力学分析法

底物特异性分析法底物Km、亲和力不同ACP、CK、LD（

-羟丁酸）抑制剂分析法对小分子量的抑制剂的特异性抑制不同LD（草酸）、ACP（L-酒石酸）、ALP（L-苯丙氨酸）

pH分析法最适pH不同LD、AST热失活分析法热稳定性不同LD、ALP蛋白酶水解法对蛋白水解酶敏感度不同LD、AST63

（一）电泳法

1.电泳材料：醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦及毛细管电泳等。2.区带显色：各同工酶区带进行酶促反应，利用底物、产物及衍生物等的颜色变化或他们与染料结合后的颜色变化进行检测，采用光密度计或荧光计扫描定量，而颜色的深浅与同工酶活性成正比。64电泳法的常用成色系统（1）人工合成的萘酚或萘胺衍生物，在酶促反应后产生萘酚或萘胺，与偶氮染料如固蓝Ｂ等生成难溶于水的有色的重氮化合物。如ALP、GGT同工酶的测定。（2）脱氢酶反应产生NAD（P）H，其中Ｈ+经PMS传递Ｈ+，交给四氮唑盐生成不溶性有色的化合物。如LDH同工酶的测定。65蛋白质同工酶支持物准备、平衡、加样、电泳固定后染色蛋白质染料不固定酶促反应产物显色扫描定量扫描定量电泳法测定同工酶与蛋白质区别支持物准备、平衡、加样、电泳66（二）色谱法

1.色谱法：利用同工酶分子量大小、所带电荷多少的不同，以及受某些离子交换剂吸附的强弱程度不同来进行分离鉴定的方法。2.柱色谱：离子交换色谱和亲和色谱等。3.操作方法费时繁琐，一般不用于临床同工酶常规检测，主要用于同工酶的分离、制备、纯化。67（三）免疫化学法

1．免疫抑制法根据同工酶的某一种亚基与相应的抗体结合后，酶活性受到抑制，而不含这种亚基的同工酶则不受影响，测定加与不加抗体前后样品中酶活性的变化，即可算出该型同工酶的活性。——LD1测定2．免疫沉淀法利用分离提纯的同工酶作为抗原制备的抗体与含该型同工酶的待测样品混合，在一定条件下形成抗原抗体复合物沉淀，离心后测定上清液中其他型别的酶活性。利用加入抗体前测得的总酶活性减去上清液中的酶活性，即可算出被沉淀的同工酶的活性。68（四）动力学分析法

1．底物特异性分析法利用不同的同工酶对底物的Km及亲和力的差异即可进行分析。如LD1对

-羟丁酸的亲和力较大Km为0.84mmol/L，而LD5对

-羟丁酸的亲和力较小Km为10mmol/L。2．抑制剂分析法利用同工酶之间结构的不同而对同一种抑制剂有不同的亲和性和反应性来进行分析。3．pH分析法利用不同的同工酶有不同的最适pH进行分析。如AST的最适pH为7.4，当pH降为6.5时，血浆AST（ASTs）活性明显降低，而线粒体AST（ASTm）则仍保持活性。4．热失活分析法利用不同同工酶的耐热性不同来进行分析与鉴定。如胎盘ALP在70℃酶活性无变化，骨ALP在55℃10min活性则丧失过半，若经65℃15分钟的样品预处理后只留下胎盘型同工酶。69ALT/AST一CK二第七节目前常用诊断酶的酶活性测定ALP三GGT

四LD五AMS六CHE七701.测定谷氨酸以酶电极法作代表，因需特殊仪器不适合临床检验2.测定丙酮酸①以赖氏法为代表的定时法②以IFCC推荐法为代表的连续监测法③偶联丙酮酸氧化酶法丙氨酸氨基转移酶与门冬氨酸氨基转移酶的测定一（一）方法选择与评价71（二）ALT推荐方法（1）LD：用兔肌来源的干粉制剂，加入白蛋白和叠氮钠来保持其活性，应没有GLDH和ALT的污染。（2）α-酮戊二酸用量：15mmol/L，基本满足了ALT最适条件对α-酮戊二酸的用量的要求，扩大了测定范围，提高了测定准确性。（3）缺陷：存在内源性丙酮酸和GLDH的干扰，采用双试剂底物启动模式可以消除部分干扰，延长延滞期也可以消除部分干扰。（4）预孵育目的：使试剂中磷酸砒哆醛与部分脱辅基的酶先结合。使脱辅基的酶恢复酶活性。72（三）AST推荐方法73比色法连续监测法荧光法化学发光法肌酸激酶测定二（一）方法选择与评价74（二）推荐方法（1）缓冲液和pH：醋酸咪唑缓冲液。（2）巯基激活物：CK是巯基酶，需要巯基试剂活化。常用N-乙酰半胱氨酸；（3）腺苷酸激酶的干扰和消除：红细胞含有大量腺苷酸激酶(AK)，使CK活性假性增高。常用的AK抑制剂以二腺苷-5-磷酸(AP5A)和AMP联用效果最好。（4）EDTA的作用：Mg2+作激活剂，各法配方中均含有Mg2+。但样品中的Ca2＋是Mg2＋的竞争性抑制剂，加入EDTA既可以络合样品中的Ca2＋又能防止N-乙酰半胱氨酸由于二价离子的催化发生的氧化，有利于试剂的稳定。（5）样品保存：CK活性不稳定，血清样品室温4小时、4℃8～12小时、冰冻下2～3天维持活性不变，由温度增加引起的灭活是不可逆的，加入巯基试剂不能恢复。样品采集后应尽快分离血清，保存于4℃冰箱。751.以布氏（Bodansky）法为代表：β-甘油磷酸钠做底物2.以金-阿（King-Armstrong）法为代表：磷酸苯二钠做底物3.以皮-劳（Bessey-Lowery-Brock）法为代表：人工合成底物：磷酸对硝基酚二钠盐（PNPP）碱性磷酸酶的测定

三（一）方法选择与评价76（1）PNPP的纯度要求：游离4-NP小于0.03%，无机磷小于1%。（2）波长设置：401nm、405nm、410nm等都可使用——4-NP的摩尔消光系数不同，F值应随之改变。（3）底物自身水解作用：酶活性计算时应扣除试剂空白变化速率。（4）缓冲液：①惰性型：如碳酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液②抑制型：如甘氨酸缓冲液③活性型：如AMP、Tris和DEA缓冲液。若用不同缓冲液测定ALP时，其参考值不同。（二）推荐方法771.L-γ-谷氨酰-α（β）-萘胺做底物，催化生成的α（β）-萘胺与重氮试剂生成红色化合物。2.γ-L-谷氨酰对硝基苯胺（GNA）做底物，催化生成的对硝基苯胺在碱性环境下呈黄色，可以连续监测。3.3-羧基-γ-L-谷氨酰对硝基苯胺（GCNA）做底物，催化生成的2-硝基-5-氨基苯甲酸在碱性环境下呈黄色，可以连续监测。γ-谷氨酰基转移酶的测定

四（一）方法选择与评价78（1）反应温度37℃时的最适pH：7.70，以甘氨酰甘氨酸和氢氧化钠做缓冲体系。（2）5-氨基-2-硝基苯甲酸在410nm的摩尔消光系数为7.96*103（pH为7.70），受pH和温度影响较大。（3）GCNA的纯度要求：对硝基苯胺应小于0.5%，5-氨基-2-硝基苯甲酸应小于0.1%。（4）底物自身