海洋细菌香港红树林的分离及次生代谢产物研究

海洋细菌香港红树林的分离及次生代谢产物研究

吕源天然产品一直是人类丰富的药物资源。随着对土地资源的深入研究，新药物的初始化合物变化变得越来越困难。传统抗生素抗剂性迅速发展，尤其是新菌病毒和新病毒。因此，人们逐渐关注尚未开发的巨大自然资源，尤其是海洋，并渴望找到新的药物特征来地球。编号为4454的海洋真菌分离自香港红树林,种属未定。本文首次研究了该菌的次级代谢产物,从其发酵培养液分离到3个化合物,通过分析波谱数据分别鉴定为尿嘧啶(A)、甘露醇(B)和草酸(C)。1实验部分1.1仪器和试剂(1)核磁共振谱仪美国Varian公司INOVA500NB超导核磁共振谱仪,英国VG公司ZAB-HS双聚焦磁质谱仪,北京X4型显微熔点仪(温度计未校正)。(2)试剂和仪器葡萄糖(C,P.),蛋白胨(B,R.),酵母膏(B,R.),粗海盐(微生物养殖用),溶剂为广州化学试剂厂生产(使用前重蒸),柱层析硅胶为青岛海洋化工厂生产的200～300目硅胶H,薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂生产的硅胶HF254,其它均为市售(AR.)试剂。1.2病毒海洋真菌4454号分离自香港红树林,无孢子生成,种属未定。1.3水调ph培养基:葡萄糖10g,蛋白胨2g,酵母膏1g,粗海盐3.5g,自来水1L,调pH7.0。110L培养基分装500mL三角瓶,每瓶装培养基200mL,1.25×105Pa灭菌15min,冷却后接种,在25℃采用间歇式摇瓶培养32～36d。1.4l乙醇破乳萃取发酵总物呈胶冻状,用纱布过滤得发酵液,发酵液50℃减压浓缩至约5L,用等体积乙酸乙酯萃取2次;胶冻状菌丝体用50L乙醇破乳,纱布过滤得到的滤液于50℃减压回收乙醇后用等体积乙酸乙酯萃取2次。所有乙酸乙酯萃取液合并,于50℃减压回收溶剂,得发酵液粗提物约18.4g,粗提物硅胶拌样,经硅胶柱层析,石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱后再用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱,反复硅胶柱层析,重结晶纯化,分别得到化合物A(20mg),B(50mg)和C(30mg)。1.5一般化合物的实验数据(1)mso-d6黄色固体,mp>300℃,FABMS(m/z):113[M+H]+;1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.89(brs,1H,NH),10.70(brs,1H,NH),7.35(d,8.5Hz,1H),5.43(dd,8.5,6.0Hz,1H);13CNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:164.8(s),152.0(s),142.6(d),100.7(d)。(2)d,5.0h,2h,2h,2h无色针状晶体,mp166～168℃,1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:4.33(d,5.0Hz,2H),4.24(t,6.0Hz,2H),4.07(d,7.0Hz,2H),3.60(m,2H),3.55(t,7.5Hz,2H),3.46(m,2H),3.38(m,2H)。(3)化合物c无色块状晶体,mp190～192℃,1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.62(brs)。2化合物的鉴定化合物A的FABMS谱在m/z113给出分子离子峰[M+H]+,1HNMR给出4个质子信号,13CNMR和DEPT谱给出4个碳信号,其中2个季碳和2个CH。这些信息提示其分子式为C4H4N2O2,计算不饱和度为4。氢谱中δ10.89(brs,1H,NH)和10.70(brs,1H,NH)为2个酰胺质子信号,δ7.35(d,8.5Hz,1H)和5.43(dd,8.5,6.0Hz,1H)为双键质子信号;13CNMR中δ164.8(s)和152.0(s)为酰胺羰基碳信号,δ142.6(d)和100.7(d)为双键碳信号。根据这些信息推断该化合物为尿嘧啶。进一步对比文献值和标准物谱图得到证实。化合物B为无色针状晶体,难溶于乙酸乙酯、甲醇、石油醚等有机溶剂,易溶于热水,能燃烧。硅胶TLC展开碘熏不显色,紫外灯照也不发荧光。测其熔点为166～168℃。这些信息初步提示可能为甘露醇。氢谱显示多个连氧质子信号和羟基质子信号,其中在δ4.33(d,5.0Hz,2H),4.07(d,7.0Hz,2H)的信号为仲醇羟基质子信号,在δ4.24(t,6.0Hz,2H)的信号为伯醇羟基质子信号,而在δ3.60(m,2H),3.55(t,7.5Hz,2H),3.46(m,2H)和3.38(m,2H)的信号为连羟基CH或CH2质子信号。这些特征与已知物甘露醇的氢谱特征一致,进一步与文献标准物的氢谱对照鉴定该化合物为甘露醇。化合物C为无色晶体,熔点为190～192℃,硅胶TLC展开紫外灯照不显色,碘熏则显白色,拖长尾,其氢谱很简单,只在δ12.12出现一个羧基活泼氢的宽单峰质子信号,因而很容易推断该化合物为草酸。甘露醇是一种在自然界广泛存在的化合物,最早发现存在于南瓜、蘑菇、洋葱以及褐海藻中。1806年Proust首先从甘露蜜树(mannaash)中分离得到,故而得名。甘露醇具有镇咳、祛痰、扩张支气管和增强肾上腺素的作用,因而在医药上用途广泛,同时也广泛应用于食品行业和其它工业。特别是它还是制造药物的重要原料,目前它仍然是抗癌药物、抗生素、心血管用药物的原料。最近,我国生产的去氧甘露醇就是良好的抗癌药物。由于甘露醇用途如此广泛,特别是最近开辟了在口香糖方面的用途,所以其需求量迅速增长,因而人们在研究各种方法以提高它的产量。传统的生产方法如天然提取法,成本过高,化学法转化率低