促肾上腺皮质激素释放因子mab和pab的多克隆抗体的制备及鉴定

促肾上腺皮质激素释放因子mab和pab的多克隆抗体的制备及鉴定

促进肾上腺皮质释放因子（crf）是一个含有41个氨基酸残基的矩阵，主要由囊动动物大脑中的小细胞组成。CRF与一些激素的分泌调节及多种生理反应有关,应激引起的血浆ACTH及糖皮质激素升高依赖于CRF的释放。睡眠剥夺(sleepdeprivation,SD)是指由于各种原因引起的睡眠丢失状态,并引起情绪、学习记忆、免疫功能等一系列改变,是机体一种急性应激反应,但其脑内机制还不完全清楚。本研究中,我们首先成功地制备了抗CRF的单克隆抗体(mAb)和多克隆抗体(pAb),初步鉴定确认其中2株mAb和pAb可用于免疫组化染色。在此基础上用其观察睡眠剥夺48h大鼠脑内CRF的变化,旨在为了解调节睡眠剥夺应激反应的脑环路提供神经形态学资料。1材料和方法1.1蛋白和细胞的制备CRF抗原购自AmericanPeptide公司;牛甲状腺球蛋白(bovinethroglobulin,BTG)和碳二亚胺均为Sigma公司产品;牛血清的蛋白(BSA)为国产分析纯级制品,购自华美公司;生物素化兔二抗、鼠二抗及ABC复合物购自美国Vector公司;Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞为本室保存;聚乙二醇(Mr4000)为德国MERK公司产品;超级新生小牛血清为杭州四季青生物技术公司产品;96孔细胞培养板及酶标板为丹麦NUNC公司产品;新西兰大白兔、Sprague-Dawley大鼠和BALB/c小鼠,均由第四军医大学实验动物中心提供。1.2方法1.2.1杂交瘤细胞的制备①免疫抗原和包被抗原的交联:选择BTG和BSA作为载体蛋白,采用碳二亚胺二步法和戊二醛二步法分别与CRF交联,制备免疫抗原BTG-CRF和检测用包被抗原BSA-CRF。②抗CRFpAb的制备:选取健康雄性新西兰种大白兔3只,体质量2.5kg左右,背部皮下多点(8～12点)和两侧腹股沟皮下单点注射抗原进行免疫。间隔3wk免疫1次,共免疫4次。首次免疫时,每只兔子用200μgBTG-CRF,溶解于1mL生理盐水,与等体积弗氏完全佐剂混合,乳化后立即使用;以后每次用量均为100μg,溶解于1mL生理盐水,与等体积不完全弗氏佐剂混合乳化后使用。③抗CRFmAb的制备:将交联蛋白BTG-CRF与完全福氏佐剂等体积混合乳化后,对每只BALB/c小鼠(雌性,6～8wk龄)皮下注射20μg(0.5mL/只)免疫,随后每隔15d以不完全福氏佐剂乳化的BTG-CRF,共免疫4次。末次免疫后,再予腹腔注射20μg(0.5mL/只),3d后取脾进行融合。杂交瘤细胞的制备按常规方法进行。筛选时,以检测抗原BSA-CRF包被ELISA板,筛选抗CRF的mAb细胞株,并测定其效价。1.2.2免疫组化crf①效价检测:新西兰家兔从第3次免疫后开始,每次免疫7～10d后从耳静脉采血,分离血清,用ELISA测定抗体效价。其步骤是将可溶性BSA-CRF抗原(1mg/L)包被于ELISA板,免疫兔血清按10倍梯度稀释成不同浓度作为一抗,并设立抗体稀释液的空白对照,孵育过夜。二抗为酶标记抗兔IgG(1∶4000,博士德公司),在37℃孵育1h。用ABTS作为底物,加入适量过氧化氢呈色。30min内观察反应孔内颜色判定结果。阳性反应呈蓝色,阴性反应为无色或极淡蓝色。自首次免疫4次后从兔颈动脉放血,分离血清,-20℃冻存待用。BALB/c小鼠从第3次免疫后从鼠尾取血,用同样方法按10倍梯度检测其效价。②交叉反应试验:将BSA-CRF按2mg/L包被于ELISA板上,4℃过夜,将5种类似物小肽AVP,[Lys8]-Vasopressin,[Asu1,6.Arg]-Vasotocin,Oxytocin和[Arg8]-Vasotocin.,抑制反应起始量为1μg,进行倍比稀释,分别与CRFpAb及mAb混合,37℃30min,洗涤后分别加入HRP标记的羊抗兔抗体或羊抗鼠抗体孵育,洗涤后显色。③mAb的Ig亚类与亚型:采用Sigma公司试剂盒的说明书进行鉴定。④秋水仙碱脑内注射进行免疫组化鉴定:2只SD大鼠侧脑室注射秋水仙碱(2g/L)6μL,约在12～24h大鼠出现尿失禁后立即常规灌注处死,取脑,切片,进行CRF免疫组织化学染色。其方法如下所述。1.2.3大鼠睡眠剥夺心理应激的小平台水环境法选健康、雄性Sprague-Dawley大鼠,体质量为(170±5)g。将动物随机分成3组:小平台组、大平台组及正常组,每组3只。实验前,使其在未注水的实验环境中(下述)充分适应1wk,以排除或减弱环境造成的心理应激。采用小平台水环境法建立大鼠睡眠剥夺模型。用本校航空心理学教研室根据文献制造的体积为(30.0×30.0×30.0)cm3的鼠箱。平台高8.0cm,小平台的面积为(6.3×6.3)cm2,大平台的面积为(18×18)cm2。在平台周围注满水,水温保持在20℃左右。水面距平台面约1.0cm。鼠在平台上可自行饮食、饮水。小平台上的大鼠若睡眠,则会由于肌肉张力松弛而跌落入水中,故置于小平台上的大鼠不会睡眠,处于睡眠剥夺状态。室内温度控制在18℃～22℃,持续以40W日光灯照射。实验时,大平台和小平台的大鼠放置在平台上连续48h。1.2.4免疫组化试验大鼠用10g/L戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉后开胸,经心灌流,先用100mL生理盐水快速灌注冲洗血液,然后用预冷的40g/L多聚甲醛固定液400mL灌流。待固定液滴注完毕,取出全脑,用40g/L多聚甲醛后固定2h,再放入200g/L蔗糖溶液4℃过夜。组织块完全沉底后,用冰冻切片机连续冠状切片,每5张切片中取1张,脑切片的厚度为50μm。先将所有切片经0.01mol/LPBS漂洗5min×3次后,浸入800mL/L甲醇和3mL/LH2O2封闭30min,PBS漂洗,再用10mg/LBSA、30mL/L羊血清和3mL/LTritonX-100封闭1h,用ABC方法进行免疫组化染色。兔或鼠的CRF免疫抗血清(1∶3000～10000)作为一抗,孵育切片,室温下36h,0.01mol/LPBS漂洗10min×3次;生物素化的羊抗兔IgG(1∶500)或羊抗小鼠IgG(1∶500)室温孵育切片4h,PBS漂洗;生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC,1∶500)室温孵育切片2h,PBS漂洗;硫酸镍胺加强DAB兰色反应呈色。当阳性产物呈深兰色而背底几乎无色时终止反应。经脱水、透明和封片后,OlympusBH-2显微镜(×20)镜检。部分切片用做免疫组化方法对照试验,一抗用BSA稀释液替代;二抗、ABC复合物同其他免疫组化反应切片,结果未见阳性表达。1.2.5统计处理在各组动物对脑内CRF表达较多的4个脑区进行阳性细胞计数,用非参数秩和检验进行显著性差异分析,以P<0.05为显著性差异。2结果2.1elisa测定兔crf血清滴度的测定所用CRF抗原是交联蛋白,分别用BTG-CRF作为免疫原,BSA-CRF作为检测原,在免疫3次后,ELISA检测兔抗CRF血清滴度为1∶10000时,A值在1以上,而单独用BTG或BSA作为包被抗原的孔中却无着色,在免疫4次后,ELISA检测兔抗CRF血清滴度为1∶100000,遂从兔颈动脉放血,分离到免疫血清约20mL。2.2冻存稳定性测定融合前血清中抗体的效价达1∶105,细胞融合率100%,得到可稳定分泌CRFmAb的杂交瘤细胞9株。将其连续培养并反复冻存后,仍能稳定分泌mAb。Ig亚类均为IgG2a,亚型为κ型,腹水效价达到1∶108。经免疫组化染色证实,有2株(1D10,2F4)可用于免疫组织化学染色,在注射秋水仙碱的大鼠脑片的下丘脑室旁核(paraverticularhypothalamicnucleus,PVN)小细胞部中染出大量阳性细胞。2.3抗k的特异性交叉反应结果表明我们制备的CRFpAb、mAb与5种存在于下丘脑室旁核的其他神经肽及其拟似小蛋白均无交叉反应。2.4大鼠脑片中表达情况与正常组相比,睡眠剥夺组的大鼠身体细瘦,皮毛蓬乱,极度敏感,易激惹。当轻触它时,经常向后退,尖叫,跳跃。用制备的CRFpAb或mAb进行染色,在正常组脑内未见到明显的CRF样免疫反应产物。在睡眠剥夺48h,大鼠脑切片上观察到,下丘脑室旁核(PVN)、杏仁核中央亚核(centralsubnucleusofAmygdala,Ace)、终纹床核的卵圆亚核(ovalsubnucleusofbednucleusofstriaterminalis,BNSTov)、孤束核(nucleusofsolitarytract,NTS)均有强烈的阳性表达,部分大脑皮质(cerebralcortex)神经元中亦有阳性表达(图1)。阳性细胞以双极或梭形细胞为主,亦可见多极细胞,胞质内阳性反应产物较淡,分布均匀,纤维细长深染,胞核未见染色。大平台对照组在对应核团中亦有阳性细胞,但数量较睡眠剥夺组明显地减少(表1)。2.5大平台组和正常组睡眠剥夺大鼠睡眠剥夺大鼠一般情况采用SPSS软件的非参数秩和检验(nonparametrictestofranktransformation),结果显示睡眠剥夺组与对照组和正常组差异显著(P<0.05),而大平台组与正常组无显著差异。3大鼠睡眠剥夺应激时脑内crf的合成目前市售的CRF抗体用于免疫组化染色效果不佳,阳性结果弱,且背底深。为了更好的进行研究,我们首先成功地制备了符合实验要求的CRF的pAb和mAb,而且所用的免疫抗原和检测抗原是不同的交联蛋白,遂使有较高的免疫原性,蛋白易于纯化。4次免疫后就检测到较高效价的稳定分泌的pAb,并用所获得的抗体在秋水仙素脑室内预处理的大鼠进行免疫组织化学染色进行鉴定。由于秋水仙素阻断轴浆流,使胞体部位合成的肽类物质积聚,局部浓度升高而易于免疫组织化学染色。我们用所制备的pAb和2株mAb在实验组染出的阳性产物分布部位,与文献报道的结果完全一致,证明所获得抗体的特异性。正常脑组织神经元中的CRF含量低,用免疫组织化学方法无法检出。对于动物,睡眠剥夺48h是一个极强的应激刺激。本实验中的结果发现在下丘脑室旁核、杏仁核中央亚核、终纹床核卵圆亚核、孤束核、大脑皮质等处神经元胞体及其突起内均出现强或较强的CRF阳性免疫反应产物,与对照组呈现显著性差异。这个结果提示在大鼠睡眠剥夺应激时脑内合成大量的CRF以适应应激的需要。下丘脑室旁核是下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的起始部位,是脑内调节自主神经和神经内分泌的整合中枢,传入和传出纤维联系广泛。终纹床核卵圆亚核是下丘脑室旁核主要的非下丘脑来源的前脑直接传入联系核团,也是杏仁核中央亚核、内侧前额皮质和外侧隔区等下丘脑室旁核间接传入脑区的中继核团。杏仁核中央亚核与行为、自主神经活动和内分泌功能的调控有关,通过终纹床核的换元或通过其与脑干的联系而间接支配下丘脑室旁核。许多研究已经证明,杏仁核中央亚核-终纹床核-下丘脑室旁