哮喘大鼠下丘脑室旁核内电池组h3受体对下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的调控

哮喘大鼠下丘脑室旁核内电池组h3受体对下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的调控

气管哮喘（哮喘）是一种慢性呼吸道疾病。临床表现为反复出现哮喘和呼吸困难，其基本特征是可逆性呼吸道阻力的增加。组胺是哺乳动物体内分布广、作用强的生物活性胺类。在脑内,组胺作为一种重要的中枢神经递质参与调控正常动物的呼吸功能活动。组胺H3受体是一类对呼吸功能活动具有重要调节作用的受体体系,组胺本身的合成与释放受分布于组胺能神经元胞体和神经末梢的组胺自身H3受体的负反馈调控。研究发现,下丘脑是中枢神经系统维持机体内环境平衡的最重要部位,位于下丘脑前部视上区的室旁核(paraventricularnuclei,PVN)既是调控呼吸功能的皮层下高位中枢,又是HPA轴功能的直接控制部位,PVN内分布有大量的组胺能神经元和H3受体。先前研究已证实PVN内组胺H3受体参与调节哮喘大鼠的呼吸功能,但是否与其调节HPA轴功能有关呢?有关这方面的研究目前未见报道。因此本实验拟通过PVN内微量给药,观察激动或阻断组胺H3受体对哮喘大鼠HPA轴功能的影响,旨在初步探讨PVN内H3受体是否能够通过调节HPA轴的功能改善哮喘症状。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试剂和仪器卵蛋白(ovalbumin,OA)、组胺H3受体激动剂R-(α)-甲基组胺[R-(α)-methylhistamine,R-(α)-MeHA]和组胺H3受体拮抗剂Thioperamide(Thio)均购自美国Sigma公司;灭活百日咳杆菌疫苗购自上海生物制品研究所;IL-10ELISA试剂盒由北京晶美生物工程有限公司提供;促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)和促肾上腺皮质激素(ACTH)放射免疫分析试剂盒由北京华英生物制品研究所提供,皮质酮(CORT)放射免疫分析试剂盒由美国DSL公司提供。高效液相色谱仪(LC-6A)购自日本岛津公司;酶标仪ELX808购自美国BIO-TEK公司产品。GC-911-γ-放射免疫计数器购自中国科技大学。1.1.2实验动物成年雄性SD大鼠,体重250～300g,购自东南大学实验动物中心,在安静、温暖(18～25℃)、避强光、明暗周期为10/14h,实验室预饲养3天后供实验使用。1.2方法1.2.1大鼠感冒1.2哮喘模型参照文献进行,即实验第1天每只大鼠腹腔注射抗原液(1ml生理盐水含卵蛋白10mg、氢氧化铝100mg、灭活百日咳杆菌疫苗5×109个)致敏,第3天再次注射上述抗原液1ml以强化。第15天用1%OA生理盐水溶液(2～3ml/min,颗粒直径≤5μm)雾化吸入,1次/天,连续2周。大鼠出现烦躁不安、呼吸急促、呼吸困难、喘息、腹肌明显收缩等哮喘症状为造模成功。哮喘大鼠随机分为模型组、假手术组、生理盐水组、R-(α)-MeHA组和Thio组。1.2.2pvn的定位和注射大鼠在戊巴比妥钠(30～40mg/kg,腹腔注射)麻醉下,固定于脑立体定位仪上,每组大鼠半数定位左侧PVN,另半数定位右侧PVN。按照GeorgePaxinosandCharlesWatson图谱,植入带芯的外径0.4mm的不锈钢外套管。以前囟为零点定位PVN,坐标为:AP-1.8mm(前囟后),LR0.2mm,H-7.9mm(颅骨下)。R-(α)-MeHA组和Thio组:PVN内微量注射R-(α)-MeHA2μg和Thioperamide5μg,给药体积均为1μl,用恒速推进器恒速(1μl/min)注射,注药后留管20min。假手术组:PVN埋管,但不注射药物。生理盐水组:PVN微量注射1μl生理盐水。1.2.3色谱条件检测3-三氯乙酸法各组大鼠PVN内微量注射药物30min后,股动脉放血处死,按文献方法取得PVN。称重,置于玻璃匀浆器中,加入25%三氯乙酸,手动匀浆1min后,10000r/min,4℃离心40min。取上清液经0.22μm滤膜过滤,贮存于-70℃待测。色谱条件:AgilentHC-C18(250mm×4.6mm);流动相为甲醇27.4%磷酸(3∶97,pH值5.5),流速0.8ml/min;检测波长:254nm,柱温:40℃;进样量:10μl。1.2.4抗凝剂、血清中edta和抑肽酶活性的测定各组大鼠PVN内微量注射30min后,股动脉放血处死,即刻取新鲜下丘脑组织,按20%(重量/体积)加入生理盐水中,低温匀浆、粉碎,4℃,3000r/min离心10min,取上清。尾静脉取血2ml,加入到含10%EDTA和抑肽酶的抗凝管中。4℃,3000r/min离心5min,取上清。放射免疫分析法检测CRH、ACTH和CORT的水平,具体操作参考试剂盒。1.2.5es法用于检测脑组织和出血的il-10水平将待测上清标本室温复融,按试剂盒说明操作,用pg/mgprot表示各标本单位质量蛋白中的IL-10含量作为最终结果。1.3统计处理采用SPSS12.0统计软件进行统计,数据以均数±标准差表示,组间比较采用q检验与方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1pvn定位手术及pvn内微量注射1l的影响与模型组PVN内组胺含量(279.27±59.66)nmol/L比较,假手术组及生理盐水组的组胺含量(281.81±57.31nmol/L;294.35±52.45nmol/L)无明显变化,提示PVN定位手术及PVN内微量注射1μl的生理盐水对组胺水平基本无影响;与生理盐水组(281.81±57.31)nmol/L比较,模型大鼠哮喘发作后,在PVN注射2μgR-(α)-MeHA,PVN内组胺含量(174.42±46.35)nmol/L显著下降(P<0.01),注射5μgThio,组胺含量明显升高(399.69±69.38nmol/L,P<0.01)。2.2盐水对激素水平的影响与模型组比较,生理盐水组及假手术组的激素含量无显著性差异,提示PVN定位手术及PVN内微量注射1μl的生理盐水对激素水平基本无影响;与生理盐水组比较,模型大鼠哮喘发作后,在PVN注射2μgR-(α)-MeHA,CRH、ACTH和CORT的含量明显升高,注射5μgThio上述效应被阻断(表1)。2.3手术因素和核团微量注射影响il-10含量与生理盐水组比较,假手术组和生理盐水组IL-10含量无显著变化,提示手术因素和核团微量注射对体内IL-10含量基本无影响;与生理盐水组比较,R-(α)-MeHA组下丘脑和外周血中IL-10含量明显上升,而Thio组IL-10含量显著下降,差异有统计学意义(表2)。3激活pvn,激活hpa轴组胺H3受体是1983年发现的一种组胺受体新亚型,在脑内分布极为广泛,几乎存在于所有的脑区。它作为组胺能神经的突触前自身受体,负反馈调节组胺的合成、释放和代谢。PVN广泛接受组胺能神经纤维的投射且分布有H3受体,作者前期研究已发现PVN内组胺H3受体参与调节哮喘大鼠的呼吸功能,这一结果提示中枢组胺能神经系统与哮喘发病关系密切,但具体机制未作进一步探讨。哮喘是一种变态反应性疾病,在各种应激因素的作用下,机体通过激活HPA轴而合成和分泌糖皮质激素。无论是动物实验还是临床研究,我们和其他实验室均发现:部分处于发作状态的动物模型或患者,其HPA轴却或多或少存在抑制现象和功能减退。PVN是HPA轴功能的直接控制部位,本实验在PVN直接给予H3受体激动剂或拮抗剂从正反两方面观察H3受体是否通过调节HPA轴的功能影响哮喘的转归。目前认为应激反应中参与调控PVN的中枢神经化学通路包括:(1)激动调节通路脑干、杏仁核、基底前脑等部位通过激活PVN激动HPA轴;(2)抑制调节通路,即局部环路神经元。PVN接受来自下丘脑局部的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricaide,GABA)能神经元投射,应激中的海马激活通过这条通路传达对PVN的抑制,从而抑制HPA轴。现代研究认为海马作为HPA轴应激反应的高位调节中枢,不仅可抑制HPA轴的应激反应而且可促进应激状态下亢进的HPA轴恢复到基础水平。海马的传出纤维主要是穹窿系统,虽然海马没有传出性纤维直接投射到PVN,但可经穹窿终止于终纹床核。PVN接受来自终纹床核的神经分布,这些神经几乎都是GABA能的。大量实验显示应激中的海马激活主要通过终纹床核的间接途径,抑制PVN神经元功能,即海马抑制HPA轴功能,此作用可能由刺激GABA能神经元来发动。目前已知道,穹窿系统不仅有传出纤维束,而且也有传入纤维束。同时,PVN与海马间接联络的传出性纤维的一部分和其传入联系是交互性的,即属于双向联系性纤维。此外,PVN接受大量组胺能神经元投射,研究发现组胺能够提高GABA能神经元的兴奋性。本研究在哮喘大鼠的PVN给予H3受体激动剂R-(α)-MeHA观察到下丘脑CRH、血浆ACTH和CORT水平升高的同时检测到PVN内组胺含量明显下降,H3受体拮抗剂则阻断此效应。本文推测激活H3受体一方面可能通过某种神经通路联系,抑制了哮喘引起的海马神经元的激活;另一方面则可能通过减少组胺的释放,降低GABA能神经元的兴奋性,两者共同作用减弱海马对PVN的抑制作用,表现为HPA轴功能的上调。但具体机制仍在研究中。近年来研究表明,IL-10可被神经内分泌和神经组织合成并影响它们的功能。IL-10不但可在下丘脑和垂体表达,而且广泛参与对HPA轴的调节作用。最近的研究发现,组胺在调节细胞因子网络中发挥着重要的作用。国外学者相继报道组胺刺激IL-10分泌的作用经H3受体介导,但这一作用仅在外周得到了证实。激动中枢组胺H3受体是否产生相同的作用,目前还没有相关报道。本研究发现PVN内微量注射R-(α)-MeHA,下丘脑IL-10水平明显升高,与模型组相比差异有统计学意义,给予H3受体拮抗剂则此效应被阻断。由此推测,激动PVN内组胺H3受体可能也引起IL-10分泌的增多。因此认为激动PVN内组胺H3受体,上调HPA轴的功能可能也与其刺激IL-10分泌的作用有关。IL-