蚂蚁冻干粉针的制备及质量控制

蚂蚁冻干粉针的制备及质量控制

椰子是中药水虱的一种。在中国大部分地区，它是最常见的商品水虱。本课题组前期对蚂蟥药材中的抗凝血活性成分进行了追踪分离,得到了系列抗凝活性物质,其中活性最强的物质命名为蚂蟥多肽(whitmanin),可作为蚂蟥抗凝活性的指标成分。由于水蛭注射液具有显著的抗凝、溶栓作用,且疗效确切,因此,其作为医院制剂在临床上广泛应用。然而,注射液(水针剂)虽然起效快,但在储存过程中易出现成分降解和析出沉淀的现象,注射用灭菌粉针则无此类情况,而且水蛭制剂所使用的水蛭基源混乱,质量标准不完善,直接影响临床使用,因此,笔者选择了水蛭商品市场中最常见的蚂蟥为原料,制备了蚂蟥冻干粉针,并建立了其质量控制方法。1药物、试剂和仪器岛津LC-10AT高效液相色谱系统,包括SPD-10A紫外检测器和Anastar色谱工作站;whitmanin对照品,本研究室自制(纯度>98%);蚂蟥药材(长沙县医药公司提供,经沈阳药科大学崔征教授鉴定);乙腈为色谱纯,其余试剂为分析纯。2方法和结果2.1提取抗凝血活性组分采用正交实验总结出以下提取精制工艺:取蚂蟥药材,粉碎后加4倍量40%的丙酮,常温浸渍提取4次,24h/次;提取液浓缩后先用60%乙醇沉淀除去杂质,再用85%的乙醇沉淀出抗凝血活性组分;85%乙醇沉淀经真空干燥,得活性部位。2.2冻干粉针的制备工艺2.2.1溶解和澄清度2005版《中国药典》对3个品种水蛭的剂量均规定为1.5～3g;本研究组药理实验结果也证明蚂蟥在该范围内安全有效,因此本研究的蚂蟥冻干粉针的剂量定为每支相当于蚂蟥药材2g。取蚂蟥活性部位5份,每份约120mg(相当于原药材2g),分别用注射用水稀释至1,2,3,4和5ml,轻轻振摇,使其溶解,观察本品的溶解情况和溶液状况。除体积为1ml的样品水溶液相对较粘稠外,其它各体积的样品水溶液均表现为粘稠度小、澄清度高。考虑冻干制剂的制备工艺和临床用药的方便,以及配制药液的溶剂的体积应在满足装量差异要求、溶解规定剂量主药以及使冻干产品复溶性好的前提下尽可能小的原则,确定冻干体积为2ml。2.2.2赋形剂的筛选冻干制剂的制备工艺关键在于赋形剂种类和用量的选择,单独用蚂蟥活性部位水溶液进行冻干,坍塌严重,而且色泽棕黄,但再溶解性和澄明度均良好,所以作者筛选了甘露醇、乳糖、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钠等5种价廉易得、应用广泛的赋形剂。分别称取5种赋形剂适量,加入适量注射用水,配制成一定浓度的溶液,微孔滤膜滤过,备用;量取微孔滤膜滤过后的蚂蟥精制液5份,分别加入不同的赋形剂溶液,每组3个比例,使最终浓度为相当于蚂蟥药材1g/ml,以外观、色泽、溶解性、溶液的澄明度、pH值等指标考察处方的合理性。结果用甘露醇作为支持剂的样品形态饱满、疏松细腻、色泽均匀、物料体积不变、溶解性好、溶液澄明,且pH值在冻干前后无明显变化。所以选定甘露醇作为本冻干制剂的赋形剂。甘露醇在注射剂中的用量范围是1%～10%。本实验分别加入1%～10%的甘露醇至澄明的蚂蟥活性部位水溶液中,每支2ml分装,预冻,冻干,考察甘露醇用量对制剂的影响,结果表明支持剂甘露醇用量大,则粉针成型性、色泽好,但用量过小或过大,成型性就差些,因此确定甘露醇的用量为5%。2.2.3预冻液ph值对制剂性能的影响注射剂的pH范围为4～9。根据上述结果,选定处方,将蚂蟥活性部位加入甘露醇,配备预冻液。并在4～9之间调节成不同pH值,每支2ml罐装,预冻,冻干,结果表明预冻液的pH值对制剂的成型性和外观色泽影响不大,但再溶解性和澄明度在pH值>6时不合格。为了对有效成分进行进一步的保护,每支加入0.9%的氯化钠,结果制剂的成型性、再溶解度和澄清度在pH值到达pH值≤7时均合格。由以上实验的结果可以确定蚂蟥冻干粉针的处方为:蚂蟥活性部位120g,甘露醇100g,氯化钠18g,加注射用水至2000ml,均匀混合,调节pH值至(6.0±0.5),滤过,分装1000瓶蚂蟥注射液。2.2.4用低热值的方法将本品置于-70℃冻干机中,待其冷却至-50℃以下,再预冻6h,抽真空8h,然后缓慢升温至-18℃左右(本制剂的最低共熔点为-18℃),再以6℃/h的速度升温至35℃,保温干燥2h,即得。此冻干曲线在不同的机器上要做一定的调整,以得到最佳的冻干效果。2.3冻干粉针的含量2.3.1whitmnin紫外吸收波长测定分别取whitmanin和甘露醇的水溶液,在200～400nm的波长范围内进行紫外扫描,结果甘露醇溶液在此范围内无吸收,对样品测定无干扰,whitmanin水溶液在220nm和280nm波长处有吸收峰。因220nm处存在末端吸收,因此选择280nm作为检测波长。whitmanin的扫描图谱见图1。2.3.2对照溶液的制备精密称取whitmanin对照品适量,加重蒸去离子水配制成1mg·ml-1的溶液,作为对照品储备液。2.3.3理论塔板数计算色谱柱为Hypersil-C18(200mm×4.6mm,5μm‚300。A)5μm‚300。A)(依利特公司,大连);流动相为乙腈-水(2∶98),加入0.03%的KH2PO4,再用36%的醋酸调pH值3.80;检测波长280nm;流速1.0ml·min-1;柱温35℃;进样量20μl。理论塔板数按whitmanin计算不低于4000,whitmnin与相邻峰的分离度大于1.5。whitmanin对照品和蚂蟥冻干粉针的HPLC图谱见图2。2.3.4标准曲线的绘制和加样回收率标准曲线与线性关系考察:取“2.3.2”项下对照品溶液,用重蒸去离子水稀释成浓度为0.186,0.371,0.561,0.743,0.942mg·ml-1的系列溶液,依“2.3.3”项进样。以whitmanin峰面积为纵坐标(A),whitmanin质量浓度(mg·ml-1)为横坐标(C),绘制标准曲线,得回归方程:A=2.266×106C-5.429×103,r=0.9995。说明在0.186～0.942mg·ml-1内线性关系良好。加样回收率实验:取已知含量的冻干粉针6份,分别置于2ml容量瓶中,加少量水溶解后稀释至刻度,摇匀。分别向6个容量瓶中按高、中、低3个浓度分别加入对照品,加入量分别相当于注射液中whitmanin含量的80%,100%和120%,按“2.2.3”项下进行测定,计算回收率和RSD。结果平均回收率为99.8%,RSD=1.8%。精密度实验:取同一批新制备样品,按“2.2.3”项下方法连续测定6次,结果吸光度的RSD为1.2%,重复性实验:取同一批冻干粉针若干支,制备6份样品溶液,并按“2.2.3”项下方法进行测定,结果吸光度的RSD为1.9%,稳定性实验:取同一批新制备样品,分别于0,2,4,6,8,12,24h按“2.2.3”项下方法测定,结果样品溶液在24h内稳定。2.3.5标准曲线测定取3批样品各2支,分别置于2ml容量瓶中,各加少量水溶解后稀释至刻度,摇匀,按“2.2.3”项下方法进样,记录色谱图,取峰面积,从标准曲线上读出供试品溶液中whitmanin的含量。结果见表1。2.4whitmnin含量测定将蚂蟥冻干粉针在温度(25±2)°C,相对湿度(60±10)%的条件下放置12个月,分别考察0,1,2,3,6,12月6个时间点的稳定性情况。结果,蚂蟥冻干粉针的形状、溶液澄明度、溶液pH值及主成分whitmanin的含量在12个月之中变化非常小,表明蚂蟥冻干粉针的稳定性良好。3讨论由于蚂蟥活性成分溶液pH值呈酸性,因此本制品在酸性条件下稳定性强于碱性条件。加入冻干保护剂氯化钠后,制剂在pH达到7时仍很稳定,但为了制剂的安全,作者选定在冻干前将提取液