定量PCR反应体系优化及实验实例

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黄国庆定量PCR反应体系优化及实验实例分析

荧光定量PCR的定量方法通用型的荧光染料检测法－SYBRGreenI法利用荧光染料（如SYBRGreenI）与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，优点是：无需另外设计荧光探针，无需特别优化条件，简便易行，成本较低，能适用于任何一款定量PCR仪，缺点是专一性不如探针法。特异性的荧光探针法－Taqman探针法利用荧光标记的特异性探针和引物来识别模版，优点是特异性更高，适用于序列专一扩增检测，不过增加了荧光探针的成本。定量PCR实验基本流程准备模板(DNA或RNA，RNA反转录成cDNA)PCR反应(DNA/cDNA+引物探针+PCRmix)样品编辑(样品名、样品类型)设置参数(循环参数、反应体积、熔解曲线)运行PCR，自动分析数据模板的制备RNA样品

realtimeRT-qPCR

是检测样本中特定基因表达量的有效方法，包含逆转录步骤和定量PCR步骤。组织或细胞总RNA抽提，以mRNA为模板反转录得到cDNA；以cDNA为模板进行定量PCR.DNA样品组织或细胞的DNA抽提总RNA的质量评价方法

1.检测RNA溶液的吸光度

280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。R在1.8－2.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是〈2.2的）。R〈1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，当R〉2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。

2.RNA的电泳图谱

电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA

smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好。

总RNA的质量评价方法（续）3.保温试验

方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000

ng的RNA加入至0.5

ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10

ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1

h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1

h。

时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。

RNA质量判定标准

项目合格不合格备注Ratio2.0≥X≥1.8X＜1.8或X＞2.2一般是1.8－2，但不能高于2.2，如果高于2.2可能是完全水解了。电泳条带28S、18S条带应清晰锐利，并且28S条带的亮度在18S条带的两倍或者两倍以上，无DNA杂带28S、18S条带不清晰锐利，有向前拖尾。28S条带的亮度与18S条带亮度相当或者更低，有DNA杂带这项指标是关键性指标低温实验70℃条带和-20℃条带无明显差异。70℃条带和-20℃条带有明显差异。如果内源性RNA酶的污染，两者间的条带差异是非常明显的。引物的设计原则上下游引物要保守

为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200bp片段进行PCR扩增。上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复碱基的出现，尤其是要避免4个或超过4个G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组DNA的扩增。探针的设计原则1.保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。2.Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃。3.确保探针中GC含量在30-80%。4.避免探针中多个重复碱基的出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基5.探针的5’端不能为G，因为G碱基可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。6.Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基。7.避免探针与引物之间形成二级结构。8.对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。SYBRI染料法实验优化方案ComponentsFinalConc.DNA4-40ng（2－5ul）PCRbuffer1×dNTPs各0.2mMMgCl22－5mMForwardPrimer0.2-0.4uMReversePrimer0.2-0.4uMSYBRGreenI0.2－1×Taq酶1－2UDDH2O补足总体积20ulTips：提高镁离子浓度可以降低SYBRGreenI对PCR反应的抑制作用。我们建议在用SYBRGreenI进行荧光PCR反应时，镁离子浓度要比无SYBRGreenI的普通PCR反应要高出0.5到3mM。Taqman探针法实验优化方案ComponentsFinalConc.DNA4-40ng（2－5ul）PCRbuffer1×dNTPs各0.2mMMgCl22－4mMForwardPrimer0.2-0.4uMReversePrimer0.2-0.4uMTaqman0.2uMTaq酶1－2UDDH2O补足总体积20ulTips：2StepRT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为cDNA(1-100ngRNA反转录所得cDNA)模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。引物二聚体的解决（一）1.引物的设计问题