应用荧光原位杂交技术对山羊染色体核型分析的对比研究

应用荧光原位杂交技术对山羊染色体核型分析的对比研究

20世纪60年代，山羊细胞培养和染色核型分析的应用得到了广泛应用。这是目前最常用的产前诊断方法，用于诊断胎儿染色体疾病。分裂中期的培养细胞G显带染色体核型分析被认为是诊断胎儿染色体异常的金标准。但该技术受到细胞培养时间限制,检测周期较长,效率低。荧光免疫原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)技术从20世纪90年代初开始用于产前诊断领域,应用间期羊水细胞进行产前诊断具有简便、快速、特异性强等优点。为评价这两种检测技术在产前诊断中的应用价值,对我院208例孕妇进行羊水细胞培养及染色体核型分析,其中53例同时进行FISH检测。现将染色体异常发生情况、检测成功率等报告如下。1数据和方法1.1不同年龄、孕周及接种者染色体数目选择2009年1月至2010年2月在我院采集羊水进行产前遗传学诊断的208例孕妇作为研究对象,常规进行羊水细胞培养+染色体核型分析。208例孕妇年龄19~46岁,平均(32.10±5.87)岁。采集时孕周为16+2~28周。部分知情同意患者(53例)同时行FISH检测13、18、21、X、Y这5种染色体的数目。受检孕妇的产前诊断指征:高龄(孕妇年龄≥35岁)79例,分娩过染色体异常患儿13例,夫妇一方为染色体异常3例,唐氏筛查高危人群172例,有娩出畸形儿史8例,超声提示胎儿畸形1例(注:其中多例具有两种以上指征)。1.2方法1.2.1羊膜腔穿刺超声定位及引导下,经腹壁行羊膜腔穿刺术,取羊水20~24mL置于无菌玻璃试管内保存。1.2.2原理观察和核型分析取羊水16~20mL,800g/min离心10min后弃去上清,沉渣制成细胞悬液后接种于羊水细胞培养基中,置于CO2培养箱中37℃培养,第6天换液并观察细胞生长情况。当羊水细胞贴壁生长旺盛,镜下见多个克隆时收获,常规制片,G带显色,核型计数不少于30个分裂相,分析5个核型。如疑为异常核型或嵌合型,则计数不少于50个分裂相。1.2.3fish检测1.2.3.glp13绿色/glp21红色探针(北京金菩嘉公司的产前染色体数目检测试剂盒)第一组探针:GLP13(绿色)/GLP21(红色);第二组探针:CSP18(天蓝色)/CSPX(绿色)/CSPY(红色)1.2.3.u3000结论(1)样本玻片制备:离心收集细胞,去上清,胶原酶B消化,KCl低渗溶液温育,预固定,固定,去上清制成细胞悬液,滴片并老化。(2)玻片预处理:SSC溶液漂洗,胃蛋白酶工作液浸泡10min,SSC溶液漂洗,置于梯度乙醇中脱水,自然干燥。(3)变性杂交:探针配制,离心,将10μL探针混合物滴加于玻片杂交区域,立即加盖盖玻片,用橡皮胶封边,75℃共变性5min,42℃杂交16h。(4)玻片洗涤:SSC溶液漂洗,乙醇漂洗。(5)复染:暗处自然干燥,DAPI复染剂复染,暗处放置。(6)结果观察与判断:随机计数50个羊水细胞,判断标准为:正常:90%以上的细胞显示正常信号类型;异常:60%以上细胞出现异常信号类型;无法判读:扩大计数至100个细胞,以判断最后结果。2结果2.1ssr单次穿刺成功率208例患者,共有199例在羊水细胞培养成功后进行了染色体核型分析,诊断成功率为95.7%(199/208),其中羊水细胞培养一次成功率90.9%(189/208),报告所需时间平均为(22.49±6.12)d;其余9例在羊水培养失败后,拒绝再次进行穿刺取材,最终未能完成产前诊断。而全部53例采用FISH进行诊断者,均一次获得成功,报告所需时间为2~4d。FISH诊断发现了1例染色体数目异常,与金标准“核型分析”结果一致,无假阳性或假阴性结果,其检测染色体数目异常的敏感度和特异度均为100%(如表1所示)。2.2核型分析+fish诊断结果208例患者中共检出染色体异常16例,检出率为8.04%(16/199)。结果如表2所示,其中结构异常12例,数目异常4例。53例核型分析+FISH诊断的患者,共发现染色体异常4例(表3中编号13~16号),占7.55%(4/53),其中羊水培养发现结构异常3例(1例为嵌合体),数目异常1例(18-三体,核型分析及FISH诊断结果一致)。2例18-三体患者产前超声可见心脏结构异常(室间隔缺损),胎儿娩出后外观未见大体畸形。在染色体数目的诊断上,核型分析与FISH诊断的一致率为100%。3讨论3.1ssr检测结果产前诊断是提高人口素质的重要手段之一。羊水细胞染色体核型分析方法是传统产前诊断中用得最多且结果较为稳定、准确可靠的方法,既可检测染色体非整倍体异常(数目异常),也可检测染色体结构异常,被认为是产前诊断的“金标准”。然而由于核型分析建立在羊水细胞体外培养的基础上,受细胞体外培养时间及培养条件限制,存在耗时长(一般需经3周)、失败率高、标本用量大、效率偏低等缺陷。FISH技术是近年发展出的针对特定染色体进行数目诊断的一种新方法,它采用直接或间接荧光标记的DNA特异性探针与靶细胞中同源序列的核酸进行杂交,实现对目的DNA片段或基因的定量和定位分析。基于一种DNA探针只能检出一个相应的DNA序列并显色的原理,通过计数信号数目可以判定相应染色体数目。由于信号杂交既可用于中期染色体,也可用于间期染色质,因此可以在获取羊水细胞后无需细胞培养而直接进行检测,有效降低实验所需时间,提供成功率。本研究中采用金菩嘉公司提供的多色荧光标记探针,针对13、18、21、X、Y这5种染色体进行数目检测。结果显示进行FISH检测时,平均报告时间明显短于细胞培养(如结果2.1所述),平均所需羊水量(8~10mL)少于细胞培养(16~20mL);而上述5种染色体数目的诊断中,二者的一致率达到100%,未发生误诊或漏诊情况。3.2染色体核型分析研究表明13、18、21、X、Y这5对染色体非整倍体发生率约占所有染色体非整倍体发生率的65%,占所有染色体异常活婴的95%。本研究中所有的染色体数目异常也均发生在上述5对染色体中。但由于FISH检测的原理建立在DNA探针特异性结合的基础上,因此FISH无法诊断染色体结构异常。有学者提出,对于高龄孕妇、血清学筛查高危孕妇,B超未见异常的情况下,用FISH或PCR技术取代传统的核型分析存在一定的风险,约0.4%有临床意义的染色体异常将会被漏诊。Leung等曾经提出对于高龄孕妇如果仅用FISH检测将会漏诊50%核型分析可检测到的染色体异常。本研究中,199例完成产前诊断者,共发现16例异常核型,其中数目异常4例,占25%,其余均为结构异常,如臂间倒位、平衡易位。53例FISH+核型分析者,共发现4例异常,其中数目异常1例,占25%,结构异常3例,占75%。单纯进行FISH检测,将造成上述结构异常的漏诊。Caine等认为产前诊断最佳方案为FISH+染色体核型分析或者PCR+染色体核型分析。Weise等提出在仔细了解其优缺点下,非整倍体快速产前诊断是一个强大有力的产前诊断工具。张卫社等提出在产前诊断中实施三阶梯诊断程序(G显带,G显带/FISH,G显带/FISH/CGH)有助于提高核型的确诊率及规范染色体诊断流程。由于染色体结构异常,如9号染色体臂间倒位,以及一些多态性,如16H+、y=18,在正常人群中亦可发生,因此是否应该联合进行FISH+核型分析的方法进行诊断,结构异常及多态性改变是否具有临床意义,这些患者是否必须终止妊娠,如何评价其临床意义,尚需进行进一步研究。综合本资料及其它文献报道数据,FISH检测快捷,成功率高,可以缓解患者及家属的心理焦虑,而羊水细胞培养染色体核型分析诊断更为全面,准确性高。针对13、18、21、X、Y这5对染色体进行数目,仅能满足绝大多数染色体病的产前诊断需要。接受产前诊断的高危患者,除染色体数目异常外,尚可能存在其它染色体结构异常,单纯使用FISH可能发生漏诊。联合应用FISH检测和