微生物实验综合ppt

微生物实验——组员：***，***，***α-淀粉酶酶活力测定1.1碘比色法1.1.1原理：酶促催化反应分解淀粉等底物（反应物）产物为麦芽糖、糊精等。反应式：淀粉→红色糊精。淀粉及糊精检测原理：碘检测1.2DNS法1.2.1原理：淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：酶活力测定步骤发酵液（酶液）2%淀粉液20mL+5mLpH6.0缓冲液预热5min（60℃）预热5min（60℃）吸取0.5mL混匀、计时（保温60℃），反应开始在白瓷板上定时取样（1滴）比色比色终点，计下反应时间（与标准比色管颜色相同）代入公式计算酶活力单位1mL标准糊精液＋3mL标准稀碘液混匀标准比色管（红棕色）对照比色确定反应终点DNS酶力测定步骤（流程）1ml稀释酶液40℃水浴保温5min加入2.0mlDNS1ml稀释酶液40℃水浴保温10min加入2.0mlDNS40℃水浴保温10min沸水浴5min沸水浴5min冷却定容至25ml冷却定容至25ml540nm比色测定OD值540nm作比色调“0”、“100”用加入1.0ml1%淀粉溶液（预先40℃水浴保温5min）加入1.0ml1%淀粉溶液（预先40℃水浴保温5min）40℃水浴保温5min代入回归方程计算出麦芽糖生成量实验结果碘测法：我们小组记录反应时间为5分20秒，每隔30s滴一次。酶活力单位=48N/t带入此式计算得90.06（u/ml）DNS法：将实验数据带入Excel得到标准曲线方程：y=0.545x-0.029，测得OD540=0.245代入上式计算得淀粉酶酶活力=500（u/ml）OD280=0.40，OD260=0.42带入蛋白质含量（mg/mL）=（1.45×A280－0.74×A260）×N得蛋白质含量为27（mg/ml）比酶活力=酶活力单位/蛋白质含量=500/27=18.52（umg）α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化检测2.1基本原理分离培养基：利用相关含淀粉平板培养基进行分离（其它成分根据实际需要添加）；分离方法：采用十倍梯度稀释涂布平板，经培养后挑取单菌落；检测方法：利用淀粉遇碘变蓝的性质，平板加入卢哥氏碘液后，显示淀粉酶扩散水解淀粉而产生的透明圈情况——透明圈直径与菌落直径之比判断；同时可以结合糊化淀粉冷藏后变性透明度降低，淀粉酶扩散水解淀粉也会产透明圈。结果分析稀释度10-410-510-610-7细菌总数培养皿号123平均123平均123平均123平均菌落数无法计数无法计数59617565567523CFU/g3.25*108菌落数培养皿号123平均123平均123平均123平均菌落数0000000000002132CFU/g1*108产淀粉比例30.7%α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定3.1基本原理摇瓶培养发酵技术是在抗生素生产的需求条件下发展而来的，浅层培养发酵→深层培养发酵（实验室、工业生产）.根据用途配制含有适合营养基质的液体培养基.细胞悬浮于相应液体培养基质中，通过振荡，细胞得到充分溶解氧，接触较为新鲜的营养物质，细胞代谢活性较高。本次实验基本流程准备发酵培养基灭菌冷却后接种环接种（1瓶/株）恒温摇瓶培养发酵液棉花过滤测定酶活力确定1-2株复发酵菌株以上为初筛发酵培养（使用斜面菌种）灭菌一级液体活化菌种液体菌种接种于发酵培养基（3-5瓶/株）准备发酵培养基恒温摇瓶培养发酵液棉花过滤测定酶活力以上为复筛发酵培养（使用液体活化菌种）3.4结果记录分析菌株编号反应时间稀释倍数酶活力单位（u/ml）分秒分钟17307.5106426356.581072.9437071068.5748081060重复瓶号反应时间稀释倍数酶活力单位（u/um）分秒