神经生物学实验指导书

神经生物学试验指导书试验一脑内重要神经核团和神经生物学争论方法简介Methodsforneuroscienceresearchandnucleiinbrain试验目的解神经生物学争论的常用方法。试验器材、试剂及试验材料手术刀、毛剪、注射器，1%戊巴比妥钠(PentobarbitalSodium)、依文氏蓝(EvansBlue)，大鼠。试验步骤脑的大致构造和重要神经核团等构造。重要的核团〔神经内分泌相关的丘脑下部核团〕PV〔室周核PeNSON〔视上核、ME〔正中隆起、Hippocampus〔海马〕等。下表给同的，因此具体位置应查阅图谱。神经核团距离前囟〔mm〕中心线两侧〔mm〕距脑背侧〔mm〕PVN〔室周核〕-1.0~-4.20.0~0.85.0~5.5PeN〔室旁核〕0.0~-3.20.0~0.56.5~9.5SON〔视上核〕0.0~-1.81.0~2.38.5~8.8ME〔正中隆起〕-2.4~-3.40.0~0.59.5~10.0Hippocampus〔海马〕-1.8~-6.20.5~6.33.2~8.0试验内容戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠〔40mg/kg；在颅骨前囟后3-5mm处打孔；用微量注射器吸入3μl依文氏蓝，注入大鼠背侧三脑室。大鼠断头，除去颅骨，观看脑的构造。GeorgePaxinosandCharlesWatson，TheRatBraininStereofaxiccoordinates，Academicpress，1986江湾Ⅰ型脑定位仪的使用脑立体定位仪的原理脑立体定位仪分为两大类：直线式和赤道式。直线式脑立体定位仪的设计原则利用动物颅骨外表的某些解剖标志同脑外表及深部某一构造的相对恒定关系，从外部确定脑深部各构造的位置。用立体空间直角坐标，以mm为单位，描述脑深部某构造所在的空间位置。用一结实的金属主框，加上杆、夹组成准确而对称的头夹。用一组有三维立体滑尺的电极移动架来导向，电极可准确地插入脑内某一指定构造。使用方法装上耳杆、上颌固定器、电极移动架，调整主框架至水平，测试两耳杆中心接触处是否在正中处。装上架假电极，用假电极测定耳杆中心的高度,然后将电极移到门齿板上缘,调整门齿板5mm〔该调整须依据图谱定，要与图谱中的方法保持全都。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠40mg/k，将其固定在定位仪上。按图谱确定核团的位置，在颅骨相应位置打孔。按图谱在相应核团埋管。神经生物学争论的常用方法大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像技术。形态学方法体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。束路追踪法追踪神经元之间的联系是神经解剖学争论中的重大目标，它对争论神经元的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要意义。这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变〔顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变〕20世纪40年20世纪50年月进展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过〔HRP〕HRP的积存。不久LaVail正式使用HRPHRPHR4~天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反响而显现出来。被标记的神经元可以清楚的显示胞体、树突及轴突。除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。免疫组织化学，检测细胞内多肽、蛋白质及膜外表抗原和受体等大分免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感度高，进展快速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要争论手段。近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。组织的多肽和蛋白质种类繁多，具有抗原性。分别纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗原注入另〔免疫球蛋白再以荧光素、酶、铁蛋白或胶体金标记，用这种标记抗体处理组织切片或细胞，标记抗体即与细胞的相应蛋白质〔抗原〕发生特异性结合。常用的荧光素是异硫氰酸荧光素〔FITC〕和四甲基异硫氰酸罗丹明〔TRITC，在荧光显微镜下可观看荧光抗体抗原复合物。常用的酶是辣根过氧化物酶〔horseradishperoxidase,HRP从辣根菜中提取的，它的底物是，3－二氨基、联苯胺DA〕和HO,HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观看。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原2 2的结合，也可在光镜和电镜下观看。标记抗体被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的抗原直接结合。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分别的抗体〔第一抗体简称一抗〕再〔抗原〔其次抗体简称二抗先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原一抗－标记二抗复合物。间接法中的一个抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供给，使用便利。间接法中较常用的是一种称之为过氧化物酶－抗过氧化物酶复合物法〔peroxidase-antiperoxidasecomplexmethod,PAS法，该法除需一抗和二抗外，还需制备HRP标记的抗酶抗体，即以HRP作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP3个酶2个抗酶抗体组成的相当稳定的环形PAPPAP复合物处理后，再以DAB显色，即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个10剂的应用，为检测微量抗原、受体、抗体开拓了途径。生物素〔biotin〕H，是从卵黄和肝中提取的一种小分子物质〔分子量244.3；亲合素avidi〕又称卵白素，是从卵白中提取的一种糖蛋白〔分子量68k。每个亲合素分子有生物素结合的4个位点，二者可结实结合成不行逆〔labelledavidin-biotinmethod,LAB法：将亲合素与标记物HR〕结合，一个亲合素可结合多个HR；将生物素与抗体〔一抗与二抗〔或通过一抗〕先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提bridgedavidin-biotinmethod,BAB法：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也到达多层〔avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod,ABC法生物素－过氧化物酶复合物ABC复合物ABC复合物结合，最终形成晶格样构造的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏度。现有配制现成的ABC药盒商品供给，操作简便，是目前广泛应用的一种方法。原位杂交术是一种核酸分子杂交技术，它是通过检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位争论细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。其根本原理是依据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针prob，与组织切片或细胞内的待测核酸〔RNA或DNA片段〕进展杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观看目的mRNADNA大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNADNA探针(cDNA);②应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNARNA探针(cDNA);③依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNAcRNAcDNA32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是争论遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是争论细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA和特异性，它是免疫细胞化学的根底上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调整机制的，已成为当前神经生物学争论的重要手段。生理学方法神经生物学争论中的生理学方法有行为学方法、神经递质释放量的测定等，其中行为学方法最为常用。7.4.2行为学方法20世纪初提出的。条件反射是动物个体生活过程中适应环境的变化，在非条件反射根底上渐渐形成的。形成条件反射的根本条件就是无关刺激与非条件刺激在时间上的结合，这个过程称为强化。要形成条件反射除需要屡次强化外，还需要神经系统的正常活动。(工具性)条件反射，美国心理学家斯金纳(B．F．skinner)把一只饿鼠放入试验箱内，当它偶然踩在杠杆上时，即喂食以强化这一动作，经屡次重复，鼠即会自动踩杠杆而得食。在此根底上还可以进一步训练动物只对某一个待定信号，如灯光、铃声消灭后，做出踩杠杆的动作，才给以食物强化，这类必需通过自己某种活动(操作)作性条件反射和经典性条件反射的根本原理是一样的，它们都以强化和神经系统的正常活动为根本条件，但它们之间也有不同之处。在形成操作性条件反射过程中，动物可以自由地活动，它通过主动操作来到达确定的目的；但在形成经典性条件反射时，动物往往被束缚着，是被动地承受刺激。另外，在操作性条件反射中强化只同反响(操作)有关，并消灭在反响之后；而在经典性条件反射中，强化是同刺激有关，而且消灭在反响之前。7.4.2电生理学的方法电生理学的方法包括胞外记录、胞内记录、脑内电刺激、电压钳、膜片钳、脑电图等技术。电生理学发源于1791年。电流计的制造和应用于电生理学，初步满足了记录生物电活动的变化量小而变化速度快的特点。1922年Erlanger和Gasser用了电子管放大器和阴极射线示线器，才彻底满足了记录生物电活动的根本特点。从今神经生理学得以迅猛进展。20世纪40年月以来，英国剑桥大学HodgkinBernstein膜学说的根底上，建立了动作电位的钠学说，说明白神经冲动的传导理论。约在同一时期，Forbes和Renshaw等运用微电极开头了争论中枢神经系统神经元活动的工作。Hodgkin等人为准确测量神经活通过离子流的测定来分析离子通道开放及关闭的动力学变化。双微电极电压钳技术是把两根尖端小于0.5μm的玻璃电极插入细胞内分别作为电位记录电极和电流注入电极。电位记录电极引出的膜电位经电压钳仪的前置放大器放大后，输入至电压钳仪的运算放大器的负输入端，而人为把握的指令电位输入其整输入端，两者的不断进展比较，将差值送入驱动放大电路，两者的任何差异都会被放大电路放大，并通过电流注入电极将相反方向的电流注入细胞，是膜电位钳制在指令电位水平。此时，注入细胞的电流值与标本兴奋时的跨膜电流值大小相等，方向相反。在此根底上,Neher又进展了膜片钳技术。它是将尖端直径仅为1μm的玻璃电极吸附到细胞膜外表上，对微电极内施加负压，微电极与细胞膜形成10GΩ的高阻封接，可记录膜上的pA级的离子通道电流，为从分子水平了解生物膜离子单通道的开、关动力学，通透性和选择性供给了直接手段。为此Neher获得1991胞群体活动的总和性电位，在临床诊断方面具有重要价值。神经系统的电生理方法，对神经科学的理论进展起着重要作用。生物化学的方法经典的生物化学方法包括离心、电泳、层析、质谱等。由于生物化学方法与药理学、免疫学等其他学科相结合，又进展了放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)、放射受体和免疫印迹等方面。离心法是各种制备、鉴定方法的起始步骤，几乎没有一个试验没有离心法，也几乎没有一个试验仅用离心法就能完成。各种层析法是用来制备、鉴定和分别物质的主要手段，通常需将几种不同的层析法HPLC和FPLCRIA是用来检测生物体内低含量物质〔如神经介质、激素〕的重要手段，也是对抗体进展检验的重要手段。RIA主要用来分析争论受体的特性，也可用于测定某一受体的配体的含量及分析比较各种配体的作用强度。免疫印迹法结合了电泳及KIA的优点，是鉴定蛋白质及肽类分子的抱负方法。分子生物学的方法分子生物学技术同神经生物学结合产生了分子神经生物学，分子生物学技术在神经生物学中的应用有基因的分子克隆及表达、聚合酶链反响〔PolymeraseChainReaction，PCR〕、遗传连锁分析、反向遗传学等。7.4.2PCRPCR是利用耐高温的DNA聚合酶体外快速扩增DNA的技术。通过PCR可以简便、快速地从微PCR技术原理是将欲扩增的DNA做模板，以和模板正链和负链互补的两种寡聚核苷酸做引物，经过模板DNADNA聚合酶作用下发生引物链延长反响的三步循环来扩增两引物间的DNA片段。每一循环的DNA产物经变性后又成为下一个循环的模板DNA。这样，目的DNA2n30DNA量就可到达原来的上百万倍。7.4.2神经与精神性遗传疾病的基因定位、分别克隆与突变检测基因定位是基于基因的连锁分析和关联分析。在家系中，位于同一染色体上的两个位点〔致病基因和遗传坐标〕在减数分裂的过程中会发生交换和重组。重组率越高，两个位点在一起传给后代的时机就越少，反之，越高。通过用掩盖密度适当的遗传图中的遗传坐标在家系中进展连锁分析，以此找到与某以作标严密连锁的致病基因，从而确定该基因在染色体上的粗略位置。常用的遗传坐标有RFLP、小卫星坐标、微卫星坐标及单核苷酸多态坐标等。关联分析是在可能的候选致病基因四周选择遗传坐标等位片段多态性，在正常人和病人之间进展比较，得到某一坐标等位片段和引起疾病基因关联的相对危急度。基因的分别与克隆的根本原理是在克隆有人基因组的YAC〔BACcosmid等文库中找到对应于基因定位的染色体区域，通过STS是载有该区域片段的文库按正确方向排列成重叠群。查找到存在这些片段上的基因，再用适宜的限制性内切酶进展切割分别，并克隆到按设计要求的载体上。影像技术在神经生物学争论中的应用计算机断层扫描术〔CT〕CTX光源，X光检测器和计算机系统。位于头颅一侧的X光源发出一束平行的X光束，X光束透过头颅后由位于头颅另一侧的X光检测器接收。X光源和X光检测器可围绕头颅作180度旋转，在每个旋转角度上都可以得到一组放射密度测量数据。计算机把成千上万的不同位点的放射密度换算成相应的衰减系数，然后依据每一个位点的衰减系数大小用不同的黑白亮度来显示。CT可清楚地显示颅骨、脑组织和脑脊液，但不能用于检测大脑的功能。正电子放射计算机断层扫描〔PositronEmissionTomography，ＰＥＴ〕正电子放射计算机断层扫描〔PositronEmissionTomography，ＰＥＴ〕是核医学进展的一项技术，代表了当代最先进的无创伤性高品质影像诊断的技术，是高水平核医学诊断的标志，也是现代医学必不行少的高技术。ＰＥＴ的独特作用是以代谢显像和定量分析为根底，应用组成人体主要元素的短命核素如11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、18Ｆ等正电子核素为示踪剂，不仅可快速获得多层面断层影象、三维定量结果以及三维全身扫描，而且还可以从分子水平动态观看到代谢物或药物在人体内的生理生化变化，用以争论人体生理、生化、化学递质、受体乃至基因转变。ＰＥＴ可以说是同位素放射计算机关心断层〔ＥＣＴ〕的一种。从核内释放出与一般电子一样但电荷相反的粒子，即正电子。正电子是一种反物质，从核内放出后很快于环境中自由电子碰撞湮灭，转化为一对方向相反、能量为511kev的γ光子。假设在这对光子飞行方向上对置一对探测器，便可以几乎在同时承受到这两个光子，并可推定光子发源〔即正电子放射〕点在两控头间连线上。通过围绕360°排列的多组配对探头，经探头对间符合线路检验判定每只探头信号时间耦合性，排解其它来源射线的干扰，得到探头对连线上的一维信息，再用滤波反投射方式，将信号按探头对的空间位置向中心点反投射，便可形成与探头组连线轴平行的断层面正电子放射示踪剂分布图像。这种探测方式一次只反映一个层面的信息，与CT探测方式很接近，有用中常用多层排列的探头对，协作层间符合线路，以利探测并重建更多层面的图像。在临床中，当由正电子放射性核素所标记的示踪剂〔显像剂〕注入血流后，到达全身，聚拢在特定的器官或某一部位，通过对应的探头，承受符合线路技术，探测器从360°方向检测不同部位的光子，记录释放出光子的时间、位置数量及方向。显像装置绕人体旋转，多角度采集，信息经计算机贮存，再通过影像重建原理获得人体各部位横断、冠状断面和矢状断面影像。ＰＥＴ显像仪的构造与Ｘ线、ＣＴ或ＳＰＥＣＴ根本相像，由探头、数据处理系统、图像显示及检查床组成。大多数PET2-18氟-2-D-脱氧葡萄糖〔ＦＤＧ〕作为示踪剂，这种类型的葡萄糖与普通葡萄糖化学性质相像，可在人体中产生有标记的代谢物，并且在人体中存留时间较长，便于测量。正常脑组织、心肌组织、肾脏及膀胱组织由于高糖代谢的需要因而对ＦＤＧ摄取较多。其它一些组织如肝脏、肌肉和肠壁由于其糖代谢水平低，则对ＦＤＧ的摄取量较少，显示出的ＦＤＧ活性水平也较低。其它用于PET争论的示踪剂如[15O]HO可用来测量局部脑组织、心脏或肾脏的血流量，218F-DOPA、18F-UDRFDGPET中病人所承受的放射线剂量与CT根本相像。磁共振成像〔Magneticrexonanceimaging,MRI〕磁共振成像从原理的觉察到目前临床各种先进成像技术的应用，是基于科学家们对原子构造的不断生疏。1924年Pauli觉察电子除对原子核绕行外，还可高速自旋，有角动量和磁矩。1946年美国哈佛大学的Percell及斯坦福大学的Bloch分别独立地觉察磁共振现象并接收到核子自旋的电信号，1952年荣获诺贝尔物理奖Damadian1971MR1972年P.C.Lauterbur用共轭摄影法产生一幅试管的MR图象。1974年作出第一幅动物的肝脏图象。Radi测出不同核子的角动量和磁矩。不同核子在同一磁场中其磁矩和角动量各不一样。同一核子在不同场强的磁场中，其振荡频率也不一样。磁共振是共振现象的一种，是指原子核在进动中吸取外界能量产生的一种能量跃迁现象。这种跃迁只能消灭在相邻两个能量级之间。所谓外界能量是指一个鼓舞电磁场〔射频磁场〕，它的磁矢量在某一个平面上旋转，因此，除其旋转频率正好与原子核回转频率一样外，其自旋方向必需和核磁矩一样，原子核才会吸取到能量，这是磁共振现象的必要条件。磁共振成像技术的进展产生了很多成像技术方法，但总的设计思想是如何用磁场值来标记受检体中共振核子的空间位置。发生共振的频率与它所在的位置的磁场强度成正比。假设能使空间各点的磁场值互不一样，各处的共振频率也就不同，把共振吸取强度的频率分布显示出来，实际就是共振核子的分布，即核磁共振自旋密度图象。但不行能使同一时刻的三维空间中各点具有不同的磁场值，所以需设计突出各特定点信息的方案。要到达此目的，首先可对观测的对象进展空间编码，把争论对象简化为由nx，ny，nz个小体积〔体素〕的组成，然后承受依次测量每个体素或由体素排列的线区分率、成像时间和信噪比〔S/N〕等要求不同，产生了多种成像方法，归纳起来可分为两大类：一是投影重建法；二是非投影重建法，包括线扫描成像法和直接傅立叶变换〔fouriertransform〕成像法。StepofstereotaxicsurgeryThestereotaxicinstrumentisfixed.Toachievetheflatskullposition,theincisorbarwasadjustedaboveinterauralzero.〔accordingtotheinstructionofbrainmaps〕.Micewereanesthetizedwithsodiumpentobarbital(40mg/kgbodyweight,i.p.)forstereotaxicsurgery.Comparedtoarat,theskullofamouseispaperthin.Theairwaysrunthroughthecenterlinedirectlybetweenthetwoears.Thus,itisveryeasytostrangleamousewithevenlightlyappliedearbars.Ifearbarsareusedonamouse,thesurgeonmustbeverywatchfultoseethattheyareinfirmlyenoughtoholdtheheadstable,andthattheanimalcontinuestobeabletobreaththroughtheentireprocedure.Toavoidthis,mostresearchersworkingonmiceuseanoseonlyholder,andnotearbars.This,however,introducesseriousinstability,particularlyifthesurgeryisbacktowardthebrainstem,as theleveragetomoveincreasesthefurtherbacktheworkisbeingdone.Instabilitymeansreducedaccuracy,andmoreanimalsneeded.AnalternativeistheCunninghamheadholderformice(orneonatalrats,whereasimilarsituationapplies)thatemployslight,smallplasticear barsthatallowthesurgeontofeelthepressureofapplicationbetterthanwiththeheavystainlesssteelearbarscommonlyused.Theseallowearbarstobeusedsuccessfullyonadultmice.Stainless-steelguidecannulasareimplantedintonucleusaccordingtobrainmaps.Guidecannulaswerefixedtotheskullwiththreescrewsanddentalcement.NotesEarbarzerovs.BregmaEarbarzeroisthepointat whichtheearbarsmeetin thecenterofthestereotaxicinstrumentwhennoanimalisinstalled.Bregmaisanaturallyoccurringpointontheskullwherefourskullplatesmeetindevelopment.BregmaiswhereanAPandananteriorMLsuturelinecross.It’sposition relativetobrainlandmarkshasbeenshowntobequiteconstantintherat.Lamdaisasimilarpointlocatedmorecaudallyoverbrainstem,whereasecondMLsuturelinecrossesthemidlinesuture.Anatlasofstereotaxiccoordinatesmustemployanagreed-uponreferenceframe.Earlyatlasesusedearbarzero,andthetoothbar5mmbelowtheearcenter,asthezeroreferencepointandplane.Itwasnoticedthatthistiltedolderratsheadslessthanyoungerrats,andthatmostofthebrainwasfarawayfromthezeropointwheretheearbarsmet.Afewpublishedstudiesfoundgreateraccuracyusingbregmaandskullflat(bregmaandlamdaatthesameverticalcoordinate)astheframeofreference,andthebregma/skullflatreferencecoordinatesystemisusedinvirtuallyallstereotaxicatlasesavailabletoday.(theusers’guideofmyneurolab)思考题什么是神经核团，请列举几个神经核团。如何提高定位的准确性？参考书徐叔云等，药理试验方法学，人民卫生出版社包民等，大鼠脑立体定位图谱，人民卫生出版社徐科等，神经生物学纲要，科学出版社“:///“，关于小鼠脑图谱的网站“:///“，关于人脑图谱的网站试验二〔MicrotomeCryosta〔小〕鼠脑组织切片操作〔Howtooperateamicrotomecryostatandcutthebrainsection〕试验目的：把握显微冷冻切片机的使用，区分重要核团SOPV，海马PVN体定位图谱。试验器械和材料：大、小鼠大脑，手术器械，显微冷冻切片机，包埋剂〔胶水代替谱。试验步骤：-20℃(updown二个按钮调整,up调高温度,down,降低温度)。从-80℃冰箱取出脑组织在切片机或-20℃冰箱中放1小时左右，目的为了平衡组织温度，太冷会在切片时消灭脑片裂开的状况。用包埋剂〔胶水代替〕把组织固定在载物盘上Blocke，留意确定要把脑放正。后退样品固定器(specimenholder),固定载物盘，并适当调整摇杆,使的上下左右都正。翻开安全杆，.前进载物盘，到适当位置〔不要离的太近，以免不留神损坏刀，也不要离的太远。调整刀距〔sectionthicknessandtrimthicknes，摇动把手开头切片〔sectioning。开始的时候可以选择大一点的刀距〔trimthickness,10-500u(sectionthickness,1-20um贴片时手放在载玻片的两头，一端靠在切片机刀尾的位置轻轻往下压。比照图谱找到所要找到的核团并各留具有SON，PVN，海马〔CA1，CA2，CA3〕的典型脑片，并作上标记。**PVN确实定：确定SON后，依据图谱算出所剩刀数，切去几刀后，贴片，用伊文斯蓝染色一PVN,并向上向外扩,成伞状。把脑片保存到-20℃或-80℃冰箱，以待以后使用。清洁切片机，复原。留意：切片机格外昂贵，请好好疼惜，并且全部操作严格依据示范来，并在有教师的状况下操作。试验总结：确定SON，PVN和海马,描绘PVN外形。问题：SON，PVN和海马时视束的外形。参考文献：Joachim,F.R.KönigandDipl.Biol.RenateA.Klippel.Theratbrain:Astereotaxicatlasoftheforebrainandlowerpartsofthebrainstem.TheWilliamsandWilkinscompanyBaltimore,1963.Paxinos,G.,Watson,C.,1986.TheRatBraininStereotaxicCoordinates.Orlando:AcademicPress. Sidman,R.L.AngevineJ.B.Jr.Pierce,E.T.Atlasofthemousebrainandspinalcord.HarvardUniv.Press,1971.包民，舒斯云大鼠脑立体定位图谱人民卫生出版社。显微切片机把握面板显微切片机把握面板2.sectionthickness,右:增大,左:减小3.调整thimthickness,右:增大,左:减小4,5.指示灯:何处亮表示选择何处6,7.前进,后退载物盘sectionthicknessthimthickness选择(select):计数(count),总数(sum)或者travel10.显示屏:显示计数(count),总数(sum)travel11.重置(reset):重设置,0开头up和down:调整切片机温度A BBregma:-0.94mm，Interaural:3.10mmPVNBregma:-1.28mm，Interaural:2.52mm示海马OperatingInstruction:Setupthecryostatandcoolofmicrotomechamberto-20℃.Takethebrainoutofthe-80℃andleaveitat-20℃for1h.tobalancethetemperature.FixthebrainontheBlocker.FixtheBlockertospecimenholder.Setsectionthicknessandtrimmingthickness,Unlockthehandwheel,section.试验三：小鼠脑片免疫组织化学〔ABC法〕试验〔以AVP为例〕ImmunocytochemistryforAVPpeptidesinratbrain一、 试验目的组织化学试验原理，娴熟把握试验操作步骤。二、 试验内容和原理1981 --complex,ABC法68000，与小分子的生物素〔分子量244〕有高度亲和力〔此种亲和力比一般抗原抗体间的亲和ABC法中，抗体与抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合体结合，再进展成色反响。在此法中，抗物分子的“网络”复合体〔一个ABC20个过氧化物分子，因而可产生子杂交中。是指用免疫学原理〔从组织细胞水平进展抗原和抗体结合，通过特异的抗原抗体反响标记上可见的显示物系统来检查细胞及组avp的染色是通过免疫组织化学方法，通过特异性抗体和所测多肽的特异结合，并用二抗、三抗进展级联，最终以DAB显色，染色结avp的含量。如角蛋白(keratin)显示上皮成分、LCA显示淋巴细胞成分。只是当组织细胞中存在穿插制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍，现在由ABC法或SP法的消灭，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍乃至可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反响，使免疫组化的方法越来越便利地应用于常规诊断工作中。定位准确、形态与功能相结合：虽然聚合酶链反响(PCR)方法已经广泛地应用于疾病的诊断，但由于不能在组织和细胞内进展明确的定位而限制了PCR在病理组织学上的应用。免疫组化则可在组织和细胞中进展抗原的准确定位，因而可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中进展定位观看，这样就可以进展形态与功能相结合的争论，对于病理学争论的深入是格外有意义。三、试验器械免疫湿盒、滴管、剪刀、保鲜膜、进口膜〔parafilm、4度冰箱、37枪及枪头、酶标笔〔PAP、Apendoff四、试验所需药品一抗〔AVP抗血清、二抗〔依据一抗血清而定、三抗〔生物素标记的辣根过氧化物酶卵白素PBS〔PH7.4100.4%Tritox-100.3〔4%多聚甲醛、三种抗体的稀释液、DAB〔显色剂〕五、试剂配制10.01MPBS〔pH=7.4〕 Na2HPO4 2.9009gNaH2PO4 0.2964gNaCl 溶于去离子水，调整pH值至7.4，定容至500ml。24%多聚甲醛固定液 40mlPBS(pH7.4)稀释至40ml。30.4%Triton-X100/0.01MPBS 50ml以0.01MPBS(pH7.4)稀释至50ml。40.3%H2O2/0.01MPBS 40ml30%H2O2400ul，0.01MPBS(pH7.4)40ml。5一抗稀释液，1%BSA/0.4%Triton-X100/0.01MPBS 20mlMPBS稀释至20ml。二抗稀释液，1%BSA/0.01MPBS 20ml0.2gBSA0.01MPBS20ml。六、试验步骤14、将脑片从-20/-803、用酶标笔在脑片四周画圈，防止液体在玻片上溢流。、430min。5、0.01MPBS，5minX36、0.4%Triton-X100/0.01MPBS洗10minX17、0.01MPBS，5minX38、0.3%H2O2/0.01MPBS10minX19、0.01MPBS，5minX31010%〔1100.01MPBS3730min40ul/脑片为宜。11、倾去封闭血清液，略干，加一抗，412、0.01MPBS，5minX313、加二抗1：200，371h，40ul/脑片。14、0.01MPBS，5minX315、加三抗1：300，371h，40ul/脑片。16、0.01MPBS，5minX317DABDAB1ml1A1B1C10min。七染色图参考〔PVN〕ABC法染色时会与抗生物素蛋白结合而产生非特异性染色。对含内源性生物素或生物素样物质较丰富的组织，在应用ABC法前，应预先以0.010.0120分钟左右，以PBS53次。近中性6－6.5，故非特异性吸附很低。同时链霉抗生素蛋白可与长臂生物素及过SABC〔streptavidin-Biotin-peroxidaseComplex〕复合物，用SABCABC进展标记，可提高灵敏度〔比ABC20倍〕及降低非特异性着色。现在SABC已有成品的试剂盒出售。SABC法的操作步骤根本与ABC法一样，只不过要用SABC代替ABC标记，马上SABC试剂盒中的A液、B液各取临用前配，配好后马上参与切片中〕30分30SABC法是一个快速、简便、敏感及非特异性着色低的检测方法。ABC试剂时，应留意厂家和批号，对购进试剂应进展事先推想，以保证明验结果的稳定性。标记过程中应始终保持组织切片的潮湿。可加强阳性染色的比照度和提高灵敏度。5PBS体的时候，做到用量少而均匀。DAB8、滴加每种试剂做到快速准确，以免片子在反响中枯燥。而在-201、试验脑片中存在的是什么，是抗体，还是抗原？还是三抗？十参考文献1GolamMohammadIqbalChowdhury,TakashiFujiokaandShojiNakamura，InductionandadaptationofFosexpressionintheratbrainbytwotypesofacuterestraintstressBrainresearchBulletin,Vol.52,No.3,pp.17182,20232、S.Lacas-Gervais,aD.Maurel,bF.Hubert,fA.M.Allevard,cA.Doukary,dV.Maggi,cP.Siaud,bC.Gharib,cB.Sicard,d,eA.Calas,aandH.Hardin-Pouzeta,VasopressinandgalaninexpressioninthehypothalamusoftwoAfricanrodents,TaterillusgracilisandSteatomyscaurinus,subjectedtowater-restriction,GeneralandComparativ Endocrinology133(2023)132–1454、现代医学试验方法，汪谦主编，人民卫生出版社，1997(染色步骤英文比照)4%Polyformaldehydefixup30minPH7.40.01MPBS-bufferwash3times,10minpertime3.0.4%Tritonx-100/0.01MPBSfixup10minPBSwash3times，10minpertime5.0.3%H2O2/PBS，roomtemperature10min6.non-ironwaterwash3times，1-2minpertime7.0.01MPBS-buffer2times，5minpertime8.dropseru〔thesameassecondantibod，cultureinculture-box15-20min9.dropfirstantibod〔1：500，1％BSA/0.4%Tritoniniceboxovernight〔18-24hour〕PBSwash3times，5minpertimedropbiotine-secondantibod〔12001％BSA/0.01MPBSkeepinabout30minPBSwash3times，5minpertimedropthirdantibod〔1：300,0.01mPBS，keepinculturebox about14.PBS3times，5minpertime15.dropDAB，reaction20min16.non-ironwaterwash3times17.PBSwash试验四显微图像(Optimas6.0)的操作及原理Howtomanipulatethemicro-imageanalysisprogram(OPTIMAS6.5MediaCybernetics,Inc,SilverSpring,Md,USA)试验目的：了解并把握免疫组化试验中图象捕获及分析的原理、过程。PixeLINK〔操作系统windowsoptimas〕图象捕获数字摄像的成像原理数字摄像的原理和传统的胶片摄像原理不同。传统胶片的摄象的根本原理是：涂有溴化银晶体的感光层受光后构造变化产生潜影，通过化学方法显影工艺使潜影影象得到固定，其操作工艺简洁费时而且稳定性易受化学药剂的温度等诸多因素的影响。而数字摄像中，这一简洁过程用电荷偶合器件CCD通过电子物理方式在一瞬间完成。CCD是外表按确定排列挨次布满硅点的芯片，每个硅点相当于一般胶片中的溴化银颗粒，不同的是CCD芯片点阵的分布是按BGB〔红、绿、蓝〕三个基色为一个象素单元整齐排列的，不象溴化银颗粒那样杂乱无章。在数字成像中，CCD虽然代替了胶片成象，但它只负责光电转换的任务，而不记录影象。摄像头的工作原理和过程大致为：景物通过镜头〔LENS〕生成的光学图像投射到图像传感器外表上，然后转为电信号，经过A/D〔模数转换〕转换后变为数字图像信号，再送到数字信号处理芯片〔DSP，DIGITALSIGNALPROCESSING〕中，DSP通过一系列简洁的数学算法运算，对数字图像信号参数进展优化处理，并把处理后的信号通过USB接口传输到电脑中，经处理，通过显示器就可以看到图像了。免疫试验中图象捕获的原理将染色玻片用显微镜观看后，所成图象的光学信号被显微镜上联接着的数字摄像头接收。如上一节所述，摄像仪中的CCD将光学信号转换成可被微处理器编码的电信号。转换并编码后的信号通过与电脑主机相联的数据线，传送进电脑，并由特定的软件解码重整，以所见即所得的图片形式显示在显示屏上。软件中显示的图片可被保存在电脑硬盘上，供进一步的图象分析用。pixelink图象分析图象分析的根本原理在以抗原抗体特异性结合为根底原理的免疫组化试验中，由于不同试验条件影响下抗原量的不同，会使不同动物同一区域组织片的染色图片呈现颜色深度上的差异。在图象分析中，这样的颜色深度差异即表现为单位面积灰度积分值的不同。图象分析的最终目的，即是依据染色深浅导致的灰度值大小不同，来半定量地比较比照组和试验组、各不同条件试验组的组织染色的差异。数字图像中的两个根本概念灰度模式256级灰度。灰度图像的每0(黑色)~255(白色)之间的亮度值。RGB颜色模式：RGB用红(R)、绿(G)和蓝(B)三种色光按不同比例和强度的混合来表示。在免疫组化的试验分析中，从显微镜下得到的是ＲＧＢ模式的图片，而在数据分析中，为求灰度值，我们要将ＲＧＢ模式的图片转换成灰度模式。4.2.３Optimas.Optimas软件的功能是比较强大的。它主要被运用在图象分析上，其过程包括图象的猎取、强化、选定目标区域，选择所需值的类型〔例如面积值、光密度值等，对选定区域进展测量，计算数值，并将结果数值输出到相应的数据承受分析软件。另外，还可以用特别工具将自己的工作自动化。首先是获得图象。OPTIMAS可以支持任何可被电脑猎取的图象，例如从电脑文件中得到的图象、X射线装备、电子扫描显微镜、视频摄象机等部件捕获的图象，都可以被optimas使用。我们应中选择好自己的图象猎取工具，并且在正式使用之前进展测试，看其获得的图象是否能满足我们分析的需要。其次是强化图象。有时候，我们需要强化图象，以解决分析中的某些问题。假设图象不够清楚，无法识别，并且这问题不能用亮化图象解决，我们就可以使用图象强化这一功能。使用这系列功能OPTIMAS中，有一系列工具可以实现这一功能，例如滤镜、图象变形和象素对象素的操作。第三个步骤是选定待分析区域。也就是区域界定，通过这一步骤，我们将在整个图象中界定出一块区域，此后的数据测量，将在这一区域中进展。在OPTIMAS中，区域分为点、线、面三种类型。我们可以用工具栏或浮动栏中的工具选定区域。OPTIMAS中含有很多种测量工具，供我们选择，甚至可以将图象的密度值映射到现实世界中的现象，诸如温度、辐射度和化学吸取等。而在数据报告时，OPTIMAS则供给了很多可行的选择。但是建议使用微软excel作为数据输出承受软件。最终，我们可以使用软件中的宏工具，记录自己常需要进展的一系列操作步骤，运行它，便可以使我们的工作简洁化、自动化。还可以通过自己编制脚本，代替繁复琐碎的手工操作。TheImageAnalysisProcessThistopicdiscussesthefivegeneralstepsintheprocessofusingOPTIMAStoanalyzeimages.Itgivessomebasicpointersandtechniquesthatshouldhelpyoubecomeproductivequickly.Thefivestepsarebrieflydescribedbelow.Clickonasteptogotoafullerdiscussionofit.Step1:AcquireanimageImageacquisitionisthefirststeptowardscollectingdata.OPTIMAScansupportimageacquisitionfromfiles,scanners,infraredcameras,x-raydevices,scanningelectronmicroscopes,videocamerasextenerally,anydevicethatcanbeattachedtoacomputer.Youshouldselectyourinputdevicebasedonhowwellitcapturestheimagesyouwanttoanalyze.Itisworthwhiletoperformsometestsorcomparisonstoensurethatyourimagecapturedeviceisdeliveringthequalityofdatayouneed.Youcanoftenreceivedemonstrationsandtestsofimagecaptureequipmentfromlocalrepresentatives,suchasyourauthorizedOPTIMASdealer.Step2:EnhancetheimageImageenhancementtechniquesaresometimesnecessarytocorrectproblemswiththeimage. Anyproblemthatcannotberesolvedbylightingandpreventsyoufromeasilyrecognizingthefeaturesyouwanttomeasureshouldbeaddressedwithimageenhancementtechniques.Inconsistenciesintheimagethatwouldpreventyoufromextractingaccuratemeasurementsshouldalsobecorrected.Tohelpyoucorrectsuchproblems,OPTIMASprovidesavarietyoftools,suchasfilter,morphologicaltransforms,andpixel-to-pixeloperations.Step3:IdentifyfeaturesofinterestFeatureidentificationistheprocessoflabelingthepartsoftheimagefromwhichyouwillextractmeasurements. InOPTIMAS,featuresaremarkedwithpoints,lines,